CXCR4基因转染的猪BMSCs体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

　　作者：陈中璞1，李拥军2 ，姚玉宇2，蒋益波1，钱琪1，潘啸东1 作者单位：(1. 东南大学医学院,江苏 南京 210009; 2. 东南大学附属中大医院 心内科,江苏 南京 210009)

　　【摘要】 目的:探讨基质细胞衍生因子1(SDF1)受体CXCR4基因转染的猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为心肌样细胞的可行性。方法：按照Nance方法培养BMSCs，转染带荧光的CXCR4基因，流式细胞仪检测转染后BMSCs的细胞周期，用5氮胞苷(5aza)诱导，并行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化鉴定。对照组为未转染CXCR4基因的BMSCs。结果：体外培养的原代BMSCs 10～14 d达到融合，CXCR4基因转染后的BMSCs能成功表达CXCR4，转染前后细胞周期无明显改变。与对照组相同，经5aza刺激后，部分BMSCs成梭形，结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化染色均为阳性。结论:CXCR4基因转染的猪BMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持未分化状态,有分化成心肌样细胞的潜能。

　　【关键词】 基质细胞衍生因子1; CXCR4基因; 骨髓间充质干细胞; 体外诱导; 心肌样细胞

　　Investigation on inducing porcine BMSCs transfected by CXCR4 gene

　　into cardiomyocyteslike cells in vitro

　　CHEN Zhongpu1， LI Yongjun2， YAO Yuyu2， JIANG Yibo1， QIAN Qi1, PAN Xiaodong1 (1. Medical College, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Cardiology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the possibility of inducing porcine bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) which were transfected by CXCR4 gene first,the acceptor of SDF1, to differentiate into cardiomyocyteslike cells in vitro. Methods: BMSCs were isolated from bone marrow and purified by centrifuge.The proliferation and growth characteristics were observed in primary and passage culture.BMSCs were transfected by CXCR4 gene, then analyzed cell cycle by flowcytometer.After being cocultured with 5aza cytidine for 24 h, the cultured cells were evaluated by immunohistochemical stains. The control group was BMSCs without CXCR4 gene. Results: The cells were fused in single layer after plating for 10～14 days.BMSCs which were transfected could express CXCR4 successfully, and the cell cycle didnt changed. The same as the control group,after being cocultured with 5aza cytidine, some of transfected BMSCs became spindlelike and formed a network of myotubule. Myotubular cells were found to be stained with positively MHC, desmin and TnI. Conclusion: Porcine BMSCs which were transfected by CXCR4 gene first can be isolated from postnatal bone marrow through their adherentability, and can be induced to differentiate into cardiomyocyteslike cells in vitro.

　　[Key words] stromal cell derived factor1; CXCR4 gene; bone marrow mesenchymal stem cells; induce in vitro; cardiomyocyteslike cells

　　心肌坏死是心血管系统的常见病，其显著特征是功能性心肌细胞大量死亡。一般认为，成熟的心肌细胞是终末分化细胞，缺乏再生能力[1-2]。有研究[3]表明，少数成体心肌细胞在终末分化之后还具有分裂能力，但由于数量极少，不能达到修复损伤心肌的目的。因此，增加心肌细胞或心肌样细胞的数量可以改善此类病人的心功能，细胞移植成为治疗心肌坏死的新策略。然而单纯细胞移植的效率却不高[4-5],为提高移植效率，人们的目光转移到在干细胞的动员、归巢和分化过程中发挥重要作用的细胞因子上。其中，基质细胞衍生因子1(SDF1)与其特异性受体CXCR4相互作用，参与到干细胞动员、归巢、黏附、存活增殖的各个步骤，在心脏的细胞治疗中有着巨大的应用潜能[6-8]。而骨髓间充质干细胞(BMSCs)是全能干细胞分化而来的非造血系干细胞，具有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞等[9-12]。因此，将SDF1/CXCR4和BMSCs联合起来，将成为治疗心肌坏死的一个新途径。为此，本研究分离培养猪的BMSCs并转染CXCR4基因，经过流式细胞仪筛选和细胞周期测定后用5氮胞苷(5aza)体外诱导，探讨其分化为心肌样细胞的可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 猪BMSCs的体外分离培养和扩增

　　按照Nance方法[13]略加改进，选择健康小型猪(出生3～6个月，体质量20～25 kg，贵州香猪)，在净化工作室对猪进行无菌的骨髓穿刺术，抽取骨髓液10 ml(肝素3 000 U·ml-1抗凝)，于干细胞研究室行细胞分离。将密度为1.077 g·ml-1的FicollPaque分离液加入无菌的离心管中，采集的骨髓液用DMEM以1∶5稀释后加到FicollPaque分离液上，利用密度梯度离心法3 000 r·min-1离心20 min，分离出单个核细胞。细胞计数后以1×106 ml-1的浓度接种于加入含10%胎牛血清的完全培养液(包括低糖DMEM，10%胎牛血清，0.25 g·L-1两性霉素B)的培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，24 h后BMSCs即可贴壁，呈纺锤状，更换培养液弃去未贴壁细胞。此后每隔3 d换培养液。每天用倒置相差显微镜观察培养瓶中细胞的形态学和组织学变化。约接种10 d后，贴壁细胞近乎铺满整个培养皿底，细胞融合达90%时用0.25%的胰酶蛋白(含1 mmol·L-1 EDTA钠，Gibco公司产品)消化贴壁细胞3～5 min，按1∶3的比例重新接种传代，当传1代的贴壁细胞完全融合时得到的细胞即为BMSCs。

　　1.2 CXCR4基因转染BMSCs

　　将已构建重组载体pMSCVCXCR4/eGFP导入宿主菌，最后将构建的质粒通过慢病毒转染BMSCs。

　　1.3 BMSCs的细胞周期检测

　　转染后的BMSCs消化后，置于4 ℃预冷的70%乙醇中固定30 min，PBS漂洗3次，1 g·L-1 RNA酶37 ℃处理30 min后离心5 min，加入10 g·L-1碘化丙啶，4 ℃避光染色15 min，流式细胞仪检测。

　　1.4 诱导BMSCs向心肌样细胞分化

　　传至第3代后，以每孔5×105个细胞浓度接种于带有盖玻片的6孔培养板中,当细胞融合至80%～90%时，完全培养液中加入10 μmol·L-1 5aza，作用24 h后吸去含5aza的培养液，改用完全培养液继续培养，3 d换液1次，细胞不再传代，4周后供免疫组化检测。

　　1.5 BMSCs诱导后的鉴定

　　贴壁生长于盖玻片的细胞于室温下用4%多聚甲醛固定30 min，PBS液冲洗3 min，共3次。然后分别加入抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白，4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育10～15 min。最后加入DBA显色2～10 min，蒸馏水终止反应。细胞胞质被染成棕黄色为阳性结果，提示向心肌样细胞分化。各抗体阴性对照采用缓冲液代替一抗，其余部分操作同上。

　　2 结 果

　　2.1 BMSCs的分离培养和扩增

　　骨髓单个核细胞悬液接种于培养瓶后48 h，多数原代细胞已经贴壁，弃去悬浮细胞后继续培养，在4 d内呈相对静止状态，之后细胞生长速度加快，呈克隆集落方式增殖，多数呈长梭形，偶见宽大平坦的多边形细胞，12 d左右达到融合。传代培养后细胞呈纺锤形，形体比较均一，分布均匀。

　　2.2 CXCR4基因转染BMSCs并筛选

　　制备好带荧光的质粒成功转染BMSCs，CXCR4成功表达于BMSCs表面(图1)。A. 转染组BMSCs(未开荧光镜)

　　2.3 BMSCs的细胞周期检测

　　流式细胞仪检测转染前的细胞DNA含量结果显示，BMSCs中的S+G2期细胞约占18.18%，而处于G1期的细胞为81.81%。可见在上述培养条件下，只有少数细胞处于增殖期。转染后，S+G2期细胞约占13.79%，而处于G1期的细胞为86.21%,细胞周期无明显改变。见图2。A. 转染前BMSCs的细胞周期

　　2.4 诱导BMSCs向心肌样细胞分化

　　5aza诱导后，转染组与对照组BMSCs增生变缓，甚至趋于停滞，部分细胞死亡并从瓶底脱落，而存活的细胞形态渐趋均一，诱导后10d可见细胞形态较前更加细长，呈长梭状，细胞排列具有方向性(图3)。A. 转染组诱导前

　　2.5 BMSCs诱导后的鉴定

　　转染组与对照组BMSCs经过5aza诱导后，免疫细胞化学染色结果显示部分细胞结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I均呈阳性表达，阳性细胞呈集落样分布。各抗体阴性对照结果均无阳性表达。见图4。

　　3 讨 论

　　随着干细胞分离、培养和纯化技术的不断发展和成熟，以及对细胞因子研究的不断深入，越来越多的研究者关注于BMSCs与SDF1/CXCR4联合治疗心肌坏死。而本实验探讨SDF1受体CXCR4基因转染的猪BMSCs体外诱导分化为心肌样细胞的可行性。5aza是研究最多的干细胞分化体外诱导剂，也是目前比较公认的可以诱导BMSCs分化的药物[14-16]。

　　本实验体系根据Nance等的方法略加改进，采用密度梯度离心与贴壁筛选相结合的方法分离培养猪BMSCs。原代细胞在4 d内呈相对静止状态，以后生长加快，贴壁细胞以分散、克隆集落方式增殖，大多呈纺锤形。随着集落生长的扩大，12 d左右融合。传代后细胞不再以集落方式生长，而呈分布均匀的纺锤形，从而得到BMSCs。含有CXCR4基因的质粒成功转染BMSCs，可见CXCR4基因稳定表达于BMSCs表面。细胞周期检测结果显示81.81%的细胞在G1期，只有少数细胞处于增殖期。5aza是胞苷的类似物，能与控制向心肌分化的特异基因MyoD上的阻遏蛋白结合，引起DNA中美协胞嘧啶去甲基化，发生构型改变，调控肌动蛋白(actin)基因，启动干细胞向心肌分化[17]。BMSCs与5aza作用后发现，细胞形态较未加入5aza时更加细长，呈梭形。结蛋白是新生/成熟平滑肌、心A. 转染组结蛋白阳性表达 肌、骨骼肌细胞中肌丝的主要构成成分之一，在维持肌纤维形态、连结细胞核与细胞膜以及肌小节间的信号联系方面起重要作用;成纤维细胞中没有结蛋白表达。肌球蛋白是一种高度保守的蛋白，由轻、重链形成，是构成粗肌丝的主要成分，其构成的横桥具有ATP酶作用，与细肌丝上的肌纤蛋白合称为收缩蛋白。结蛋白和肌球蛋白重链免疫细胞化学染色阳性表明BMSCs已向肌细胞转化[18]。细肌丝中除了肌纤蛋白外,另外有两种蛋白质可影响和调控收缩蛋白质之间的相互作用,故称为调节蛋白质。一种为原肌凝蛋白,另一种为肌钙蛋白,后者含有C、T、I 3个亚单位,分别对Ca2+、原肌凝蛋白、肌纤蛋白具有高亲和力。亚单位I的作用是在亚单位C与Ca2+结合时,把信息传递给原肌凝蛋白,引起后者的分子构象发生改变,解除它对肌纤蛋白和横桥相互连接的阻碍作用。肌钙蛋白存在于骨骼肌、心肌细胞中,而平滑肌细胞中不含肌钙蛋白。本研究选用的心肌特异性肌钙蛋白I免疫染色阳性,表明BMSCs转化的肌细胞包含心肌特异性肌钙蛋白。

　　本实验结果显示转染组与对照组结蛋白、肌球蛋白重链及心肌特异性肌钙蛋白免疫细胞化学染色均为阳性，表明SDF1受体CXCR4基因转染的猪BMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持未分化状态,与未转染CXCR4基因的BMSCs一样，具有分化成心肌样细胞的潜能，转染CXCR4基因不影响其分化潜能。当然，在体内表达CXCR4的BMSCs位于特定的微环境中，有许多物质相互作用，控制干细胞的更新和分化。而我们是在体外用5aza诱导BMSCs转化，缺乏体内细胞发育所需的微环境，故所得到的肌细胞呈幼稚肌细胞样形态。BMSCs与SDF1/CXCR4联合治疗心肌坏死具有良好的应用前景，但需进一步进行体内实验研究。

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