全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶VSMC增殖及AKT1表达影响

　　作者：张青青,董果雄,张社华 作者单位：青岛大学医学院,山东 青岛 266003 附属医院心内科; 实验中心

　　【摘要】 目的 探讨全反式维甲酸(atRA)对兔颈动脉内膜损伤后内膜增生以及蛋白激酶B(AKT1)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响和机制。方法 新西兰雄性大白兔36只，随机分为6组：假手术A、B组,手术A、B组,手术并予atRA治疗A、B组(治疗A、B组)，每组各6只。各组均给予高脂饮食14 d后，手术组作颈动脉内膜损伤模型。治疗组于术前3 d开始每天给予atRA灌胃，其余操作同手术组。假手术组手术但不损伤内膜。于术后7 d处死A组动物， 28 d处死B组动物。采取颈动脉标本，对血管粥样硬化病变进行大体形态学观察，用免疫组化法检测粥样硬化病灶中AKT1、PCNA的表达水平。结果 手术组术后7 d内膜开始增生， 28 d时增生明显，粥样斑块形成，管腔狭窄，AKT1、 PCNA阳性表达明显。治疗组内膜增生较轻， 28 d时，内膜面积及斑块厚度低于手术组(t=3.797、3.704,P<0.01)，AKT1、PCNA阳性表达指数亦低于手术组(t=4.741、2.890,P<0.05)。结论atRA能抑制兔颈动脉内皮损伤后AKT1、PCNA的表达，抑制平滑肌细胞增殖，从而抑制内膜增生及动脉粥样硬化病变进程。

　　【关键词】 维甲酸;肌细胞,平滑肌;冠状动脉再狭窄;原癌基因蛋白质cakt

　　EFFECT OF ALLTRANS RETINOIC ACID ON PROLIFERATION OF VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS AND THE EXPRESSION OF AKT1 IN RABBIT CAROTID ATHEROSCLEROSIS LESIONS

　　ZHANG QINGQING, DONG GUOXIONG, ZHANG SHEHUA

　　Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the influence of alltrans retinoic acid (atRA) on intima proliferation and expressions of AKT1 and PCNA in rabbit carotid artery after endomembrane injury. Methods Thirtysix New Zealand rabbits wereevenly randomized to six groups: shamoperation group A and group B; operation group A and group B; and treatment group A and group B. All the rabbits were fed with high fat diet for 14 days. A model of carotid artery endomembrane injury was created in operation group. In treatment groups, rabbits were lavaged with atRA daily for 3 days before operation. Those in shamoperation groups underwent surgery without injuring the endomembrane. Rabbits in groups A were killed 7 days after operation and those in groups B, 28 days. Carotid specimens were taken for gross examination and immunohistochemistry study used for detection of the expressions of AKT1 and PCNA proteins. Results Seven days after operation, neointima formation was found in carotid artery in the operation group, and it became obvious afetr 28 days with atherosclerosis plaque, narrowing of arterial lumen and expressions of AKT1 and PCNA. In the treatment group, there was mild intima proliferation, and, 28 days after surgery, the intima area was smaller and the plague was thinner than that of the operation group (t=3.797, 3.704;P<0.01). The index of positive expressions of AKT1 and PCNA in the treatment group was also lower than that of the operation group (t=4.741, 2.890;P<0.05). Conclusion atRA can suppress the expressions of AKT1 and PCNA in injured endomembrane of rabbit carotid artery, inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells, and therefore inhibit neointima proliferation and progression of atherosclerosis.

　　[KEY WORDS] tretinoin; myoblasts, smooth muscle; coronary restenosis; protooncogene proteins cakt

　　经皮冠状动脉成形术(PTCA)及支架植入术已被广泛用于冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗，然而其术后的再狭窄(RS)问题影响了其远期疗效。再狭窄是受损内膜增生的表现,其主要病理机制则是血管平滑肌细胞(VSMC)的过度增殖。全反式维甲酸(atRA)是维生素A的天然衍生物，近年来研究发现它可抑制VSMC的表型转化、迁移，调节细胞内信号转导通路及细胞周期进程，从而影响新生内膜形成的多个环节[12]。蛋白激酶B(AKT1)是细胞内信号转导通路中重要的信号分子，调控细胞多种基本功能，尤其在细胞增殖和存活方面发挥着关键作用。本文旨在进一步探讨atRA抑制VSMC增生、预防RS发生的机制，为临床选药提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组及模型制作

　　新西兰雄性大白兔36只，青岛市动物实验中心提供，4月龄，体质量(2.50±0.12)kg。随机分为6组：治疗A组，治疗B组，手术A组，手术B组，假手术A组，假手术B组。治疗组和手术组每日进食150 g高脂饲料(每100 g饲料含猪油 6.0 g,胆固醇1.5 g,基础饲料92.5 g。)，假手术组每日进食150 g基础饲料，均自由饮水。各组动物饲养14 d后在无菌操作下进行手术：手术组行颈动脉内膜空气干燥术，治疗组于术前3 d开始给予atRA(重庆华邦制药公司) 6 mg·kg-1 ·d-1灌胃，其余操作同手术组。假手术组分离颈动脉但不损伤内膜。各组术后每天肌注青霉素40万单位，连续3 d。分别于术后7 d时处死A组动物，28 d时处死B组动物，取病变部位血管等距切分4～5段，40 g/L中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，血管标本横截面切片(3 μm)。

　　1.2 血管形态学及动脉粥样硬化病变检测

　　术后取出血管段，先进行大体肉眼观察。蜡块标本切片行苏木精伊红染色(HE染色)，显微镜下观察血管结构，采用图像分析软件ImagePro Plus(IPP)进行图像分析，测定各个血管截面的内膜面积(IA)、中膜面积(MA)，计算内膜/中膜面积比(I/M)、管腔狭窄度(LSD)。LSD =内膜面积/内弹力板下面积×100%，取平均值。取术后28 d切片，显微镜下观察动脉粥样硬化病变情况，根据AHA对动脉粥样硬化的分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)计数每期发生动物例数，以最重病变为准，测量动脉粥样硬化病变最厚处内弹力板至腔面垂直距离，作为该动物的最大斑块厚度。

　　1.3 AKT1和增殖细胞核抗原(PCNA)表达检测

　　采用免疫组织化学二步法行AKT1(即用型兔抗兔AKT1，武汉博士德公司)免疫组化反应，工作液未做稀释，二抗采用PV6001试剂盒(北京中杉公司)，DAB显色，苏木精复染，胞质呈棕黄、棕褐色为阳性。以PBS代替一抗作阴性对照。用IPP进行图像分析，随机测量每张切片中6个高倍视野的阳性部位平均吸光度(A)和阳性面积百分比，取其平均值。AKT1阳性表达指数=平均吸光度(A)×平均阳性面积百分比×100。用二步法进行鼠抗兔PCNA(北京中杉公司)染色，一抗稀释度为1∶100，显色步骤同AKT1。采用IPP进行图像分析，随机测量每张切片6个高倍视野的阳性胞核占总胞核比例及阳性胞核平均光吸光度(A)，计算PCNA阳性表达指数。PCNA阳性表达指数=平均阳性胞核比×平均吸光度(A)×100。

　　1.4 统计学处理

　　使用SPSS 13.0和PPMS 1.5[3]统计学软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示，数据间比较采用t检验，计数资料比较采用等级分组资料H检验。

　　2 结 果

　　2.1 肉眼观察

　　所有动物无患病、死亡。术后未发现感染，创口愈合良好。假手术A、B组内膜光滑。手术A组内膜可见脂点、脂纹及斑块，B组内膜明显增厚，表面不平整，斑块长短不一，隆起于内膜表面。atRA治疗A组内膜可见有脂点、脂纹形成，B组内膜可见斑块形成但较手术B组轻。

　　2.2 光学显微镜观察

　　假手术A、B组动脉内皮细胞结构完整,单层规则排列，紧贴于内弹力板;内弹力板结构完整，中膜层厚度均匀，基质匀称，VSMC呈环形规则排列，胞内可见梭形的细胞核，排列方向一致，两组无明显差异。手术A组管腔内皮开始增生，多为单层内皮细胞，局部呈多层，内弹力板模糊，多处可见断裂，平滑肌细胞穿过内弹力板，中膜层间隙增宽，细胞外基质增多，细胞数增多，排列紊乱，内弹力板下尤为明显;手术B组管腔内凹凸不平，粥样斑块向管腔隆起，内皮下可见脂质池形成，内膜增厚明显，内皮细胞大量增生，泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生移行明显。atRA治疗组与手术组病理变化相似，治疗A组可见有内皮增生，内弹力板有断裂，较手术A组轻;治疗B组内膜增厚程度、平滑肌细胞增生移行程度较手术B组亦轻。

　　2.3 各组IA、I/M和LSD比较

　　治疗A组IA、I/M、LSD与手术A组比较，差异无统计学意义(t=0.498～1.446,P>0.05);治疗B组IA、I/M、LSD均低于手术B组(t=3.797～ 6.893,P<0.01)。见表1。表1 各组IA、MA、I/M及LSD值比较(略)

　　2.4 各组动脉粥样硬化病变情况比较

　　术后28 d时手术组有1例观察到Ⅰ期病变，5 例观察到Ⅱ期病变;治疗组有5例观察到Ⅰ期病变，1例观察到Ⅱ期病变，治疗组病变较手术组轻，差异有显著性(H=4.89，P<0.05)。斑块厚度手术组为(0.19±0.06)mm，治疗组为(0.09±0.03)mm，两组比较，差异有显著性(t′=3.704，P<0.01)。

　　2.5 各组AKT1、PCNA 表达的比较

　　假手术A、B组AKT1仅在血管内皮细胞胞质有微量表达;手术A组AKT1在内膜增生处内膜层和中膜层高度表达，内皮细胞、平滑肌细胞及泡沫细胞的胞质、胞核均有表达，主要表达于胞质;手术B组AKT1阳性表达指数在增生内膜层与中膜层均下降，以粥样斑块深面内弹力板周围表达明显;治疗A、B组AKT1表达规律与手术组相同，但AKT1的阳性表达指数低于手术组，差异均有极显著意义(t=5.180、3.361，P<0.01)。假手术组偶见微量PCNA表达;手术组PCNA在新生内膜和中膜强表达，主要表达于细胞核;治疗组PCNA表达部位及规律与手术组一致，但治疗A、B组PCNA阳性表达指数均低于手术A、B组(t=4.741、2.890，P<0.01、0.05)。见表2。表2 各组AKT1和PCNA阳性表达指数比较(略)

　　3 讨 论

　　RS的主要机制之一就是VSMCs的过度增殖。抑制VSMCs异常增殖成为预防RS的主要手段。近年来研究发现，atRA对PTCA术后VSMCs具有明显抑制作用，是一种很有前景的防治RS发生的药物。本课题组前期实验证实，atRA可抑制平滑肌细胞的增殖。本实验的目的是进一步研究atRA抑制细胞增殖的机制。

　　组织的稳态是内环境中各种因素影响细胞的增殖活动和凋亡活动，使两方处于动态平衡的结果。任何一方面被过度激活或抑制都会打破这个平衡，使组织表现为增殖或者凋亡。因此，VSMCs的增殖和凋亡与RS的发生发展密切相关。抑制平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡成为目前防治血管异常增生性疾病的两个重要手段。而在调控细胞生物活动尤其是增殖和凋亡的复杂的信号转导网络中AKT起到了枢纽作用。

　　AKT又称作PKB(蛋白激酶B)，属于丝苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要信号分子，PI3K是主要调节AKT活性的物质，因此AKT主要参与PI3KAKT信号转导通路，通过影响下游多种效应分子的活化状态在细胞多种生理、病理过程中发挥重要作用。哺乳动物AKT至少包括3种亚型：AKT1、AKT2、AKT3，研究表明其与细胞增殖、存活、分化、凋亡、迁移等多种生物学活动有关。其中，AKT1主要促进细胞存活和增殖。PI3KAKT途径可以被多种细胞内的刺激因子以及有毒物质，如PDGF、VEGF、IGF1、AngⅡ、eNOS等所活化,并可促使其迁移至细胞核内。AKT的异常活化与多种疾病的发展有关，尤其是增殖性疾病如肿瘤，其实质是细胞增殖与凋亡失去平衡，而正是AKT途径联系了这两个事件，而且起到了主要的作用，这种作用表现为负性调节细胞凋亡，正性调节细胞增殖。一方面，AKT具有抗细胞凋亡的作用。活化的AKT可以使BAD(Bcl2家族)、BAX(Bcl2家族)、caspase9、 Par4磷酸化，发挥抗凋亡作用[46];影响转录因子家族Forkhead、NFκB、P53等，发挥细胞存活调控作用[7];另外，AKT还通过代谢途径调节细胞凋亡。另一方面，AKT具有促进细胞增殖作用，其主要通过调控细胞周期实现。AKT可以与P21、P27结合并将其磷酸化，使P27水平下降，阻断其抑制cyclinE及CDK2作用。AKT还可以在S2/M期活化cyclinB/CDC2。另外，AKT还通过磷酸化mTOR促进增殖相关基因mRNA的大量转录，合成生长增殖所需蛋白，加速细胞的增殖[8]。提示AKT在调节细胞增殖方面发挥着重要作用，其在细胞内高表达提示细胞处于过度增殖状态。

　　本实验结果显示，AKT1在正常兔颈动脉仅内皮细胞胞质少量表达,平滑肌细胞不表达;高脂饮食和内膜损伤7 d后，内膜层内皮细胞、平滑肌细胞和中膜层平滑肌细胞均大量表达;28 d后，内膜层和中膜层表达虽均有所下降，但阳性表达指数仍较高。PCNA的表达规律与其相同，而PCNA则是反映细胞增殖程度的可靠指标。由此可见，AKT1的表达与VSMCs的过度增殖密切相关，可能是调控VSMCs增殖的主要信号分子。本文研究结果还显示，治疗B组与手术B组比较，IA、I/M、LSD以及最大斑块厚度均有明显下调，差异有统计学意义。说明atRA可下调内膜增生血管内膜层以及中膜层平滑肌细胞AKT1及PCNA的表达。提示atRA具有抑制内膜损伤后增生，抑制动脉粥样硬化斑块发展的作用。这种抑制作用可能与其抑制AKT1的表达，从而抑制平滑肌细胞过度增殖有关。

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