法舒地尔对心肌急性梗死大鼠心肌组织Bc12和Bax表达及血流动力学功能影响

　　作者：潘娜娜，谭丽娟，马建英 作者单位：(青岛大学医学院附属医院心内科,山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 探讨法舒地尔对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌组织Bc12、Bax表达及血流动力学功能影响。方法 选取雄性Wistar大鼠，结扎其左前降支制作AMI 模型，将术后24 h存活的大鼠随机分为治疗组和AMI组。另随机选取10只大鼠作为假手术组，只在其左前降支下穿线不结扎。治疗组给予法舒地尔5 mg/kg腹腔注射，每日2次;AMI组和假手术组给予等量生理盐水。4周后分别测其血流动力学指标左心室收缩压(LVSP)，左心室舒张末压(LVEDP)， 左心室内压最大上升和下降速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax);RTPCR法测定Rho激酶mRNA的表达;免疫组织化学方法测定凋亡相关蛋白Bcl2及Bax表达的变化。结果 AMI组大鼠血流动力学指标、心肌组织Rho激酶mRNA、凋亡相关蛋白Bcl2及Bax表达与假手术组相比，差异均有显著性(F=14.79～178.79,q=4.85～24.95,P<0.01)。与AMI组相比，治疗组大鼠血流动力学指标改善，心肌组织Rho激酶mRNA表达减少，凋亡相关蛋白Bcl2表达增加，Bax表达减少，差异均有显著性(q=3.20～15.11,P<0.05、0.01)。结论Rho激酶参与了AMI后心肌细胞凋亡及心力衰竭的进展，法舒地尔通过抑制Rho激酶的表达减少细胞凋亡，保护缺血心肌，延缓心力衰竭进程。

　　【关键词】 心肌梗死;法舒地尔;Rho激酶类;细胞凋亡;血流动力学

　　EFFECTS OF FASUDIL ON EXPRESSIONS OF Bcl2, Bax AND HEMODYNAMICS IN INFARCTED MYOCARDIUM OF RATS

　　PAN NANA, TAN LIJUAN, MA JIANYING

　　Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the effects of fasudil on the expressions of Bcl2,Bax and the hemodynamics in myocardium of rats with acute myocardial infarction (AMI). Methods A model of AMI in Wistar rats was created by ligating left anterior descending coronary artery (LAD), for those survived for 24 hours after procedure were randomly divided into treatment group and AMI group. An additional 10 rats served as shamoperation group, the LAD was braided, but not ligated. Rats in treatment group were treated with Fasudil (5 mg/kg) intraperitoneally, twice a day, and those in AMI and shamoperation group were administered with equivalent volume of normal saline. Four weeks later, the hemodynamic pararmeters, i.e. left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular end diastolic pressure (LVEDP), the maximum rising and dropping rates of left ventricular pressure (+dp/dtmax, -dp/dtmax) were measured by catheterization. The expression of Rho kinase mRNA was measured by RTPCR, and expressions of Bcl2 and Bax protein measured by immunohistochemical staining. Results The differences of hemodynamic pararmeters, expressions of myocardial Rhokinase mRNA, Bcl2 and Bax, the apoptosisrelated proteins between shamoperation group and AMI were significant (F=14.79-178.79;q=4.85-24.95;P<0.01). Compared with those of AMI group, the hemodynamics of treatment group improved, the expressions of Rhokinase mRNA and bax decreased, and that of bcl2 increased (q=3.20-15.11;P<0.05,0.01). Conclusion Rhokinase involvs in the postAMI myocardial cell apoptosis and the development of heart failure. Fasudil delays the process of heart failure through suppressing Rho expression, decreasing cellapoptosis, and protecting ischemic heart muscle.

　　[KEY WORDS] myocardial infarction; fasudil; Rho kinases; apoptosis; hemodynamics

　　急性心肌梗死(AMI)后，心肌坏死与细胞凋亡共同导致心肌细胞数量减少，且目前认为，心肌细胞凋亡的持续存在，使心肌细胞进行性丢失，导致室壁变薄，心室扩张，心室重构，最终发展为心力衰竭[1]。因此，防治AMI后心肌细胞的持续性丢失，抑制细胞凋亡，预防心室重构，延缓心力衰竭进程成为目前研究的焦点。研究表明，AMI后心肌细胞凋亡与Rho激酶激活有关，法舒地尔是Rho激酶特异性抑制剂。动物实验证实，冠状动脉结扎术前1 h给予法舒地尔30 mg/kg 腹腔注射，能够保护缺血心肌，减少心肌梗死面积，且该作用与其抗心肌细胞凋亡

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　　效应有关[2]。但AMI后长期应用法舒地尔是否能够达到相似的效果，目前尚少有报道。本实验旨在观察AMI大鼠血流动力学指标改变及其心肌组织中Rho激酶mRNA表达、细胞凋亡相关蛋白Bcl2及Bax表达的变化，并探讨长期应用法舒地尔对上述指标的影响。现将结果报告如下。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象与分组

　　雄性Wistar大鼠62只，体质量250～300 g，购于青岛市药检所。参照文献[3]经气管切开插管，呼吸机辅助呼吸，构建AMI模型，观察心电图变化，若有明显的ST段抬高，并见结扎下方心肌变白，室壁运动减弱，表明AMI模型制作成功，否则再次结扎。大鼠术后每天给予青霉素20万单位肌肉注射, 连用3 d。将术后24 h存活的大鼠随机分为AMI组(n=12)和治疗组(n=12);另随机选取10只大鼠作为假手术组，只在其左前降支下穿线不结扎。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠的处理

　　治疗组给予法舒地尔(天津红日药业股份有限公司)5 mg/kg 腹腔注射，每日2次;AMI组和假手术组给予等量生理盐水。各组均连用4周。

　　1.2.2 血流动力学指标测定

　　4周后，称大鼠体质量，100 g/L水合氯醛麻醉，分离右颈外动脉，结扎其远心端，动脉夹夹闭近心端，20 G 静脉留置针向心方向插入血管直到动脉夹处，然后拔出留置针中的金属针，留下外面的塑料套管，连接血压换能器，并与BL420生物功能实验系统(成都泰盟科技有限公司)生理记录仪相连，整条管道及血压换能器内均需充满含有肝素的生理盐水，将塑料套管逆行送入左心室，连续记录左心室收缩压(LVSP)，左心室舒张末压(LVEDP)，左心室内压最大上升和下降速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)，分别于5、10、15 min 时各记录血流动力学指标1次，取3次记录结果的平均值作为实验值。

　　1.2.3 Rho激酶mRNA表达的测定

　　取心肌组织50 mg，按试剂盒(杭州博日生物工程有限公司)说明提取细胞总RNA，并采用RTPCR法行目的基因扩增。PCR的特异性引物由上海生物工程科技有限公司设计合成。扩增βactin基因(493 bp)上游引物的序列为：5′TGTTTGAGACCTTCAACACCCC3′，下游引物的序列为：5′ACGTCACACTTCATGATGGAATTGA3′;扩增Rho激酶基因(297 bp) 上游引物序列为：5′GGTGATGGCTATTATGGACGAGA3′，下游引物的序列为：5′TCGGAGCGTTTCCCAAGC3′。根据以下条件进行目的基因扩增反应：预变性94 ℃ 3 min; 94 ℃变性30 s，退火30 s(温度Rho激酶58 ℃，βactin55 ℃)，72 ℃延伸45 s，循环35次;最后72 ℃终末延伸5 min后终止反应。取10 μL PCR产物，于10 g/L的琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理，以βactin作为内参照计算Rho激酶mRNA的相对表达量。

　　1.2.4 凋亡相关蛋白Bax和Bcl2的表达及结果判定

　　所有标本经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，2 μm厚连续切片，免疫组织化学染色采用SP法，依照免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书并按照文献[4]标准进行操作。结果判定：镜下观察Bax、Bcl2蛋白阳性反应呈黄色或棕黄色颗粒，弥漫性分布，定位于胞膜或胞浆。通过数码显微照相采集图像，每张切片随机选取5个高倍视野，应用Image Pro Plus图像分析系统进行计算机图像分析，统一参数设定保持基线一致。计算切片各视野阳性点面积总和及累积吸光度值，以半定量分析平均吸光度值表示Bax及Bcl2蛋白阳性表达强度。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 1.7及采用PPMS 1.5[5]统计软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，组间多重比较采用单因素方差分析及q检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠生存状况

　　AMI术后24 h存活的24只大鼠，在随后4周的干预期内共死亡5只，其中治疗组3只，AMI组2只，死亡构成比分别为25.00%和16.67%，两组比较差异无显著性(P>0.05)。假手术组10只，无死亡。最后进入实验的AMI组10只，治疗组9只，假手术组10只。

　　2.2 血流动力学指标比较

　　与假手术组相比， AMI组大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低、LVEDP显著升高，差异均有显著意义(F=14.79～178.79,q=7.67～24.95，P<0.01);治疗组与AMI组相比，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著升高、LVEDP显著降低，差异均有显著性(q=3.20～6.38，P<0.05)。见表1。表1 各组大鼠血流动力学参数比较(略)

　　2.3 病理学改变

　　苏木精伊红染色显示,假手术组左心室心肌横纹清晰，心肌纤维排列整齐;无肉芽组织和增生的纤维组织;心肌间质未见炎性细胞浸润。AMI组与治疗组梗死区心肌纤维溶解断裂，心肌横纹消失，心肌组织被肉芽组织和增生的纤维组织取代，梗死区有大量炎性细胞浸润;梗死边缘区由心肌纤维、纤维组织和肉芽组织构成;非梗死区心肌纤维排列整齐，心肌横纹清晰可见;梗死区与非梗死区边界清楚，表明心肌梗死模型制作成功。

　　2.4 心肌细胞Rho激酶mRNA及Bcl2与Bax蛋白表达的变化

　　AMI组较假手术组Rho激酶mRNA及凋亡相关蛋白Bax表达明显增加，Bcl2表达明显下降，差异均有极显著意义(F=20.33～59.16，q=4.85～10.38，P<0.01)。治疗组较AMI组心肌Rho激酶mRNA及 Bax表达减少，Bcl2表达增加，差异均有显著性(q=5.20～15.11，P<0.01)。见表2。表2 各组大鼠缺血区心肌组织Rho激酶mRNA及Bcl2与Bax蛋白表达的比较(略)

　　3 讨 论

　　AMI发生后， 尽快恢复缺血心肌再灌注，是挽救濒死心肌的根本措施，但大部分AMI病人因种种原因，失去了再灌注最佳时机，对于此类病人如何有效地保护存活心肌，减少心肌的进一步丢失，预防心室重构，保护心功能，是AMI治疗中的关键。

　　AMI发生后，心肌有效工作细胞数量减少，心肌收缩力降低，泵血功能下降，导致LVSP及+dp/dtmax,-dp/dtmax降低，进而引起LVEDP升高,并逐步进展为心力衰竭。目前的医学水平尚不能完全纠正其自然病程，但如何延缓AMI引起的慢性心力衰竭的进程是当前心血管疾病研究与关注的焦点[6]。本实验结果显示，大鼠AMI后，LVSP及+dp/dtmax,-dp/dtmax较假手术组降低，LVEDP升高(P<0.01)，AMI后血流动力学参数的紊乱，反映了心脏的收缩和舒张功能严重损伤。本实验结果与理论相符。而连续给予法舒地尔4周后，却能改善血流动力学参数紊乱，升高LVSP及+dp/dtmax,-dp/dtmax,增强心肌收缩力，降低LVEDP，减轻左心室前负荷，从而改善心功能。这与张曼等[7]通过大鼠升主动脉缩窄术制备心力衰竭模型，给予法舒地尔4周治疗后的结果相符。

　　目前认为细胞凋亡参与心肌梗死的病理过程，是心肌梗死范围扩大和引起左心室收缩功能降低及早期重塑的重要因素[8]。本研究结果亦显示，AMI大鼠心肌组织中Rho激酶mRNA表达升高，凋亡相关蛋白Bax表达增加，Bcl2表达减少。而应用法舒地尔治疗4周后，与应用生理盐水的AMI大鼠相比，心肌组织中Rho激酶mRNA表达降低，凋亡相关蛋白Bax表达减少，Bcl2表达增加，差异均有显著性(P<0.01)。究其原因：①Rho激酶是小G蛋白的下游效应器之一，可参与多种细胞的生命现象。Rho激酶的高表达和过度激活与多种疾病相关，目前尚未发现Rho激酶低表达或活性不足所导致的疾病[9]。Rho激酶能够与多种血管活性物质相互作用，通过调控肌球蛋白轻链磷酸化和脱磷酸化，影响平滑肌细胞的功能和结构，直接参与心血管疾病的病理过程，与心血管疾病的发生发展密切相关。法舒地尔是Rho激酶特异性抑制剂，其主要通过与ATP竞争Rho激酶催化区结合位点，阻断Rho激酶的激活，在明显改善心功能的同时,心肌细胞内[Ca2+]i却无明显变化[7]，从而可以减少心肌梗死后心肌细胞钙超载，减轻心肌损伤。本实验结果亦显示，心肌梗死后长期、小剂量应用法舒地尔能够降低 Rho激酶mRNA表达水平，保护缺血心肌，改善心功能。②细胞凋亡是在细胞外部因素刺激下由基因调控的主动性死亡过程，多种因素可通过调控凋亡相关基因的表达，启动细胞凋亡进程。 Bcl2与Bax是公认的与凋亡密切相关的调控蛋白。Bcl2 主要分布在线粒体外膜，可以调节膜通透性，主要功能是促进细胞生存，抑制细胞凋亡; Bax位于胞质中，当Bax高表达时，可从胞质转位至线粒体膜，与Bcl2 结合形成异二聚体，使之灭活，改变线粒体膜的通透性，引起线粒体损伤，促进细胞凋亡。心肌细胞凋亡是缺血和非缺血性心肌病心肌细胞死亡的主要形式之一，在心室重塑及心力衰竭的发生、发展过

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　　程中起着重要的作用。 研究表明，Rho激酶参与细胞凋亡的各个阶段，在细胞凋亡的发生发展过程中起关键作用[10]，这其中的具体机制尚不明确。体外实验证明，腺病毒过度表达激活的RhoA作用于Rho激酶可导致心肌细胞肥大，通过上调Bax引起线粒体途径的心肌细胞的凋亡[11]。本研究结果亦显示，AMI大鼠缺血区心肌组织中Bax表达较假手术组增多，同时Bcl2表达减少，而应用法舒地尔能够使Bax表达减少，Bcl2表达增多，说明法舒地尔能够通过影响Bcl2及Bax的表达，保护心肌细胞，减少细胞凋亡，改善心功能。

　　综上所述，Rho激酶特异性抑制剂法舒地尔，能够通过抑制Rho激酶的活性而减少AMI后心肌细胞凋亡，从而达到保护缺血心肌，减少心肌有效工作细胞的进一步丢失，改善心功能的目的。除此之外，法舒地尔亦可能是通过抑制神经内分泌激活及强力抗氧化作用，增加内皮型一氧化氮合成酶(eNOS) 的表达，促进一氧化氮生成，减轻细胞内钙超载，减少心肌细胞凋亡诱导因素对心肌的影响，起到心肌保护作用。目前，法舒地尔主要用于蛛网膜下隙出血术后脑血管痉挛、脑缺血等的防治。近年来，随着其药理作用及临床应用研究的不断深入，法舒地尔被越来越多地应用于心血管领域，并取得了大量成果，有望成为防治心血管疾病的新的治疗药物。

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