ECE-1基因敲除小鼠RAAS系统激活及其意义

作者：杨波, 江本宪昭, 中山和彦    作者单位：1.神户大学大学院 医学系研究科 内科学讲座 循环器内科学，神户市，日本国 650－0017；2.解放军总医院心内科，北京市，中华人民共和国 100853 　　【摘要】  目的：探讨内皮转换酶－1（ECE-1）基因敲除小鼠的肾素－血管紧张素－醛固酮系统（RAAS）的表达水平及其意义。方法：使用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）比较ECE-1基因敲除小鼠与野生型小鼠RAAS系统的表达水平。给ECE-1基因敲除小鼠和野生型小鼠注射RAAS抑制剂缬沙坦（valsartan），给药前及给药后1周、2周，测定血压和心率。结果：RAAS系统的重要成分血管紧张素转换酶、血管紧张素II 1型受体、血管紧张素原在ECE-1基因敲除小鼠呈现上调表达。给药前后比较，基因敲除小鼠收缩压下降比野生型小鼠显著(P<0.001)。结论：内皮系统被抑制的时候，RAAS系统代偿性上调。同时抑制内皮系统和RAAS系统更有利于控制血压。

　　【关键词】  肾素-血管紧张素系统；网状内皮系统；基因敲除

　　Expression level of rennin|angiotensin|aldosterone system  in endothelin|converting enzyme-1  gene knockout mice and its significance

　　YANG Bo,JIANGBEN Xian|zhao,ZHONGSHAN He|yan

　　Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007,16(6):534

　　Abstract：Objective:To investigate the expression level of rennin|angiotensin|aldosterone system (RAAS) in endothelin|converting enzyme-1 (ECE-1)  gene knockout mice and its significance.Methods:To compare RAAS expression level in ECE-1 knockout mice and wile type (WT) mice with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).RAAS antagonist Valsartan was injected into ECE-1 knockout mice and WT mice.Systolic blood pressure and heart rate were measured before and 1|week, 2|week after drug injection.Results:The important components of RAAS ［angiotensin-converting enzyme(ACE); angiotensin II type 1 receptor(AT1); angiotensinogen(AGT)］ were upregulated in ECE-1 knockout mice.Systolic blood pressure of ECE-1 knockout mice was significantly decreased than WT mice after Valsartan injection (P<0.001).Conclusion:RAAS is compensatory up|regulated when endothelin system is inhibited.It is benefit for controlling blood pressure when both RAAS and endothelin system are blockaded.

　　Author′s　address：Division of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, 650-0017, Japan

　　Key words：Rennin|angiotensin system (RAS); Reticuloe endothelin system;Gene knockout    　　肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和内皮系统（endothelin system，ET）是迄今已经确认的最重要的两个血管加压系统[1，2]，对于RAAS和ET与心血管疾病的关系的研究已经相当深入而广泛。但是这两个系统之间的关系和相互作用的研究仍很匮乏。本研究的目的是探讨在内皮素转换酶－1（endothelin|converting enzyme-1, ECE-1）基因缺失的情况下，试验小鼠RAAS的变化以及其可能的临床意义。为方便研究，本实验采用ECE-1基因敲除小鼠为研究对象。该动物模型为美国得克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center)的Yanagisawa M等在1998年研究成功[3]。该动物模型目前仅有2个实验室合法使用，除上述美国实验室外，另一个就是本文作者所在的实验室，本文作者之一的Noriaki Emoto作为该动物模型的创建者之一，被授权在日本用于心脏相关疾病的研究。该动物模型有3个亚型：野生型(ECE-1+/+，wide type, WT)，杂合型(ECE-1+/-)，纯合型(ECE-1-/-)。野生型的ECE活性为100％，杂合型为73％，纯合型为0，但是纯合型小鼠因为严重的心血管系统/神经系统畸形，根本无法生存，在胚胎期间或者出生时，即已经死亡，故不能用于试验研究[3]。本实验使用野生型与杂合型作为研究对象，比较在ECE水平不同的情况下，RAAS系统的表达水平差异及其可能的临床意义。

　　1  资料与方法

　　1.1  试验动物

　　16周龄、雄性ECE-1基因敲除杂合型小鼠与其同窝出生的野生型小鼠，每组5只。该种群小鼠的第一代来自美国得克萨斯大学西南医学中心。

　　1.2  基因表达水平检测

　　1.2.1  RNA提取：使用5％戊巴比妥腹腔麻醉小鼠，取心脏，液氮处理后，迅速冻存于－80℃冰箱。适量标本放入15ml试管，加入1 ml Isogen（提取RNA的试剂），打碎后，加入0.2 ml 氯仿，离心后取上清，加入0.5 ml异丙基乙醇，再次离心后，弃上清，加入75％甲醇1 ml，离心后弃上清，加入适量二乙基焦磷酰胺（DEPC）水，保存于－80℃冰箱。

　　1.2.2  反转录多聚酶链式反应(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)：使用Invitrogen公司的First strand synthesis system试剂盒。以GAPDH（甘油醛－3－磷酸脱氢酶）为内参照标准，调整标本的磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的表达量到一致时，分别使用ACE(angiotensin-converting enzyme, 血管紧张素转换酶)、AT1(angiotensin II type 1 receptor,血管紧张素II 1型受体)、AGT(angiotensinogen,血管紧张素原)引物进行PCR反应，1％凝胶电泳鉴定，比较野生型与杂合型小鼠的基因表达水平。

　　引物序列：ACE：上游引物5′-GATGATTGTCCCAAAGCTGG；下游引物5′-TAGGTAATTGCCAAAGGGCC；

　　AT1：上游引物5′-GATGATTGTCCCAAAGCTGG；下游引物5′-TAGGTAATTGCCAAAGGGCC；

　　AGT：上游引物5′-TTGTTGAGAGCTTGGGTCCCTTCA-3′;下游引物5′-CAGACACTGAGGTGCTGTTGTCCA-3′。

　　1.2.3  选择另一批16周龄、雄性ECE-1基因敲除杂合型小鼠与其同窝出生的野生型小鼠，每组5只。经尾静脉注射Valsartan(日本武田制药公司赠送)10mg/kg，1次/d，持续2周。给药前、给药后1周、2周，使用日本Muromachi Kikai公司的MK-2000型大鼠/小鼠血压测量仪测量尾动脉血压和心率。

　　1.3  统计学处理

　　采用Stata  7.0统计软件分析数据。各组数据以均值±标准差(±s)表示。计量资料比较采用方差分析，计数资料采用卡方检验。P<0.05为差异有显著性。

　　2  结  果

　　2.1   RAAS系统的重要成分ACE、AT1、AGT    三者在杂合型ECE-1基因敲除（ECE-1+/-）小鼠都呈上调表达，与野生型小鼠相比，上调表达趋势明显（图1）。

　　2.2  给药Valsartan前、后收缩压、心率变化    　　见表1及图2，3。表1  两型小鼠静注缬沙坦（Valsartan）前、后收缩压、心率变化（略）

　　3  讨  论

　　Yanagisawa M等1988年从猪主动脉内皮细胞的体外培养上清中分离并纯化出一种21个氨基酸的多肽。体外试验标明，这种多肽对猪冠状动脉具有收缩作用，这就是内皮因子[4]。这一划时代的重要发现开启了另一条研究血管收缩物质的途径。此后陆续发现了内皮因子的不同亚型：内皮因子－1，内皮因子－2，内皮因子－3，以及一系列受体[5]。一系列基础研究直接促成了内皮因子A和内皮因子β体拮抗剂博沙坦(Bosentan)的发明，并在2001年得到美国食品与药品管理局(FDA)的认可，有效地用于治疗肺动脉高压[6,7]。

　　对于传统的血管加压系统：RAAS系统和近20年广泛研究的ET系统，各国学者逐渐形成了统一认识，即在动脉硬化性疾病的发生发展中，这两个系统均有促进作用[8]。但迄今为止，在动脉硬化形成的过程中，RAAS系统和ET系统之间是否存在相互影响？其影响形式、程度如何？可能的机制和作用途径如何？这一系列问题至今没有答案。有学者研究发现，内皮因子－1可以明显促进醛固酮分泌[9]，降低肾素分泌[10]，但是其结果如何解释，以及如何在防治心血管疾病中应用，至今仍令人迷惑。

　　鉴于此，本实验的基本设计思路是，以内皮转换酶－1基因敲除的动物模型为研究对象，从研究比较RAAS系统表达水平差异着手，观察在内皮系统表达水平低下的动物，RAAS系统如何变化。随后给予血管紧张受体拮抗剂（ARB）降压药物治疗，拮抗试验动物的RAAS系统，观察血压变化。

　　内皮转换酶－1（ECE-1）的作用是激活大内皮因子－1（big ET-1），产生具有活性的内皮因子－1（ET-1），后者具有血管收缩作用。本实验使用的ECE-1基因敲除小鼠，是杂合型小鼠，即一条染色体的ECE-1基因正常存在，另一条染色体的ECE-1基因缺失。杂合型小鼠的内皮转换酶活性大约保留了73％，而内皮因子－1的水平下降了大约一半[3]。本研究结果发现，与野生型小鼠比较，杂合型ECE-1基因敲除小鼠的RAAS系统的重要成分（ACE、AT-1、AGT）均呈现上调表达。随后的药物研究发现，在给予RAAS系统拮抗剂Valsartan之后，两组小鼠血压都有下降趋势，但是杂合型ECE-1基因敲除小鼠下降更明显。而对心率的影响，两组没有统计学差别，而且即使两组小鼠心率有轻微上升，但仍在小鼠的正常心率范围之内，故心率变化不是本文的主要发现和关注焦点。对于上述实验结果的解释是，在内皮系统被抑制的情况下（ECE-1基因敲除，内皮因子－1表达下降），RAAS系统表现为代偿性上调（基因敲除小鼠的ACE、AT-1、AGT表达水平高于野生型小鼠），RAAS系统和内皮系统呈现“此消彼涨”的趋势；在进一步抑制了RAAS系统的情况下（给予RAAS系统拮抗剂），杂合型ECE-1基因小鼠的血压下降远远比野生型小鼠明显。这就给予我们重要提示，对于降压治疗，应该“双管齐下”，即同时抑制RAAS系统和内皮系统，可以达到更好的降压效果。对于今后高血压疾病的治疗趋势，上述概念的提出具有重要的提示作用。笔者通过文献检索，没有找到相关的以基础研究、动物试验为依据的提出“同时抑制RAAS和内皮系统有益于进一步控制高血压”的概念，而且，由于应用的动物模型的特殊性，本研究是世界首次应用ECE-1基因敲除小鼠研究RAAS系统和内皮系统的关系，并提出上述双重抑制概念的研究。

　　作为系列研究，本课题将应用另外两种基因敲除小鼠、并采用不同的试验方法，进一步证实上述结论的正确性，深入探讨RAAS系统和内皮系统相互作用的机制，最终目的是为临床治疗高血压以及其他心血管相关疾病提供理论和试验依据。

【参考文献】　　［1］Rossi GP, Sacchetto A, Cesari M, et al.Interactions between endothelin-1 and the renin|angiotensin|aldosterone system［J］.Cardiovascular Research，1999， 43: 300-307.

　　［2］Masaki T.Possible role of endothelin in endothelial regulation of vascular tone［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，1995， 35: 235-255.

　　［3］Yanagisawa H, Yanagisawa M, Kapur RP, et al.Dual genetic pathways of endothelin|mediated intercellular signaling revealed by targeted disruption of endothelin converting enzyme-1 gene［J］.Development，1998，125: 825-836.

　　［4］Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells［J］.Nature，1988， 332: 411-415.

　　［5］Masaki T.Historical review: Endothelin［J］.2004， 25(4): 219-224.

　　［6］Kaluski E, Cotter G, Leitman M, et al.Clinical and hemodynamic effects of bosentan dose optimization in symptomatic heart failure patients with severe systolic dysfunction, associated with secondary pulmonary hypertension-a multi|center randomized study［J］. 2007，109(4): 273-280.

　　［7］ Goissen C, Ghyselen L, Tourneux P, et al.Persistent pulmonary hypertension of the newborn with transposition of the great arteries: successful treatment with bosentan［J］.Eur J Pediatr,2007，Aug 15， [Epub ahead of print] .

　　［8］Touyz RM, Schiffrin EL.Role of endothelin in human hypertension［J］.Can J Physiol Pharmacol，2003， 81: 533-541.

　　［9］Nussdorfer GG, Rossi GP, Belloni AS.The role of endothelins in the paracrine control of the secretion and growth of the adrenal cortex［J］.Int Rev Cytol，1997， 171: 267-308.

　　［10］Kramer BK, Schricker K, Scholz H, et al.Role of endothelins for renin regulation［J］.Kidney Int Suppl，1996， 55: s119-121.