柯萨奇B组病毒在心血管疾病发生中的作用

作者：蒋文玲，罗宪玲，黄 革，邝素娟，李运雄，李东风，荣卡彬，黄小穗，孟锦绣    作者单位：广东省人民医院医学研究中心，广东 广州 510080         【摘要】  目的：了解柯萨奇B组病毒（CVB）在心脏疾病患者中的感染状况，探讨CVB感染与心血管疾病的内在关系。方法：采用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）和反转录-聚合酶链反应（RT-PCR），进行CVB IgG抗体和核酸检测。结果：心脏病组CVB IgG阳性率为44.8%（112/250），对照组抗体阳性率为16.7%（18/108），两者有显著性差异（P<0.05）。CVB RNA检测结果显示，心脏病组阳性率为20.4%（51/250），对照组为3.7%（4/108），两者比较有显著性差异（P<0.05 ）。结论：在心脏病患者中CVB感染较普遍，应引起重视。

        【关键词】  柯萨奇病毒感染；酶联免疫吸附测定；心血管疾病

        Effect of Coxsackie virus B in genesis of cardiovascular disease/JIANG Wenling,LUO Xianling,HUANG Ge,KUANG Sujuan,LI Yunxiong,LI Dongfeng,RONG Kabin,HUANG Xiaosui,MENG Jinxiu//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009，18（2）:128

        Abstract：Objective:To study the infection of Coxsackie virus B(CVB) in cardiovascular disease and correlation between infection of CVB and cardiovascular disease.Methods:The enzymelinked immunosorbant assay and reverse transcription polymerase chain reaction were performed to examined the CVB IgG antibody and nucleic acid.Results:The positive rate of CVB IgG antibody in cardiac disease group was 44.8%(112/250),and significant higher than that of control group(16.7%,18/108),P<0.05.The positive rate of CVB RNA in cardiac disease group was 20.4%(51/250),and significant higher than that of control group(3.7%,4/108),P<0.05.Conclusion:The infection of CVB is widespread in cardiovascular disease patients,must pay more attention to that.

        Author′s　address：Centre of Medical Research,People′Hospital of Guangdong,Guangzhou,Guangdong,510080,China

        Key words：Coxsackic virus infection;Enzymelinked immunosorbant assay;Cardiovascular disease

        柯萨奇B组病毒（Coxsackie virus B，CVB）是严重的致病病原，其感染可以引起广泛的疾病[1]，除能引起无菌性脑炎、发热、肺炎等疾病外，还可诱发心脏疾患。近年来，柯萨奇病毒感染报告不断增加，发病率也不断上升，对人类健康造成威胁[2,3]。为了解该病毒在人群中的感染状况，探讨柯萨奇B组病毒在心脏疾病中发生、发展中的作用，本研究对广州地区就诊的部分心脏病患者和体检正常者进行了血清及分子流行病学调查，现将结果报道如下。

        1  资料与方法

        1.1  一般资料

        心脏病组：临床诊断为冠心病、风湿性心脏病、高血压性心脏病患者250例，均为广东省人民医院心血管门诊和住院病人，年龄36～84，平均61岁。男161例，女89例。正常对照组：无心脏病的体检正常人108例，年龄25～76，平均45岁。

        1.2  样本采集和处理

        心脏病组与正常对照组均外周静脉取血，分装于枸椽酸钠抗凝管和干燥管内各2ml。干燥管的标本用作分离血清。抗凝管的标本在分离血浆后加入红细胞裂解液和二乙基焦磷酰胺（DEPC）水，混匀后离心弃上清，加入RNA裂解液和氯仿，混匀离心，取上清，加入异丙醇，混匀后加到带收集管的吸附柱中，离心，加入去蛋白液，离心，加洗涤液离心，最后在吸附膜中央加入纯水溶解，离心，即获RNA。提取的RNA和分离的血清均置-70℃冰箱保存待检。

        1.3  间接酶联免疫吸附试验（ELISA）

        于酶标反应板内加入病毒抗原液，置湿盒内4℃过夜。磷酸盐缓冲液（PBS）洗板3次，每次5 min，加封闭液37℃1 h，洗板后加待检血清，置37℃1 h，洗板，加酶结合物，37℃1 h，洗板，加底物显色15 min，观察结果（CVB IgG ELISA检测试剂由武汉大学医学院病毒研究所提供）。

        1.4  逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

        用Gold软件根据CBV5′端非编码区高度保守的RNA序列选择设计合成引物，序列为5′-CCC CGG ACT GAG TAT CAA TA-3′；5′-GCA GTT AGG ATT AGG ATT AGC CGC AT-3′，扩增片段为299bp（由上海博亚生物公司合成）。逆转录和PCR反应步骤：在1.5ml的Eppendorf管中加入DEPC水、10×Buffer（RT）、引物2和RNA模板，93℃3 min，冰浴2 min，再加入10×Buffer、RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶（均为美国Promega产品），43℃水浴90 min后进行PCR扩增。反应系统包括10×dNTP、引物1、引物2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、无菌纯水。反应参数为93℃变性6 min，94℃1 min、55℃1 min、72℃1 min，共35个循环。反应产物用2.5%的琼脂糖进行凝胶电泳，电压80～100 mV，40～60 min观察结果。

        1.5  统计学处理

        采用x2检验进行计数资料统计分析。

        2  结  果

        2.1  CBV IgG抗体检测结果

        ELISA法检测结果：CVB IgG抗体阳性130例（36.3%）。其中，心脏病组250例，阳性112例（44.8%），对照组108例，阳性18例（16.7%）。两组间有显著性差异（P<0.05）。分型检测以CVB3抗体阳性率最高（19.6%），其次为CVB2（9.6%）、CVB5（8.8%）、CVB1（8.4%）、CVB4（4%）和CVB6（2.8%）。

        2.2  CVB RT-PCR检测结果

        结果显示CVB RNA总阳性率为15.4%（55/ 358）。其中心脏病组CVB RNA阳性率为20.4%（51/250），对照组阳性率为3.7%（4/108），两组比较有显著性差异（P<0.05）。

        3  讨  论

        CVB属于小RNA科肠道病毒属。该病毒是一种同属型别众多，所致疾病复杂的病毒。世界卫生组织公布的一份关于全球性病毒感染与心血管疾病关系的流行病学调查中指出，CVB在21种不同病毒中位居第一。与其他一些研究结果相似[4,5]。

        CVB型别较多，产生的抗原性较为复杂，其中6个型别间的结构蛋白存有较大氨基酸同源性，各型间具交叉性抗原决定簇[6]。目前在对柯萨奇B组病毒的病原学诊断上，ELISA及PCR法因快速、敏感、特异性强等特点已用于检测CVB感染后病毒特异性抗体及核酸，这对CVB感染后血中病毒核酸及抗体的消长、临床诊断和预后判断均有指导意义[7,8]。本研究分别用PCR和间接ELISA法对广州地区就诊的部分心脏病患者进行了CVB IgG抗体和核酸检测。结果显示250例心脏病患者血清标本CVB 1～6型IgG抗体阳性112例，其中以CVB3阳性率最高，表明CVB3的嗜心性较强，感染性较高。有21例标本两型同时阳性，显示CVB感染与心血管疾病的发生有关，且感染有病毒型的差异。分组检测结果显示，心脏病组CVB IgG 阳性率为44.8%，对照组为16.7%（P<0.05）.RT-PCR检测心脏病组CVB阳性率为20.4%，对照组3.7%，两者有显著性差异（P<0.05)。本研究血清和分子流行病学研究结果显示，CVB感染与心血管疾病虽有关联，但由于CVB致病的复杂性和多样性，二者之间的关系尚需进一步研究证实。

        【参考文献】        ［1］金 奇.医学分子病毒[M].北京:科学出版社,2001:579.

        ［2］Grist NR，Reid D.Epidemiology of viral infections of the heart[M].London:Edward Amolk,1993：23-30.

        ［3］程 翔,李 彬,廖玉华,等.医护人员柯萨奇病毒感染与病毒性心肌炎发病情况分析[J].心血管康复医学杂志,2004,13(4):328.

        ［4］Andreletti L，Hober D，Becquart P，et al.Evidence of interrelationships between verus replication and myocardial damage in persisted cardiac infection[J].J Med Virol,1997，52:206.

        ［5］Bermard NF，David MK.Enteroviruses:polioviruses，coxsackieviruses，echoviruses and newer enteroviruse[J].Viorlogy，1996，297(3):666-675.

        ［6］徐耀光,周晓峰,刘立德.分子病毒学[M].武汉：湖北科学技术出版社,2000：313-324.

        ［7］Nicholson F，Ajetunmobi J F，Li M，et al.Molecular detection and serotypic analysis of enterovirus RNA in archival specimens from patients with myocarditis[J].Br Heart，1995，74，522-527.

        ［8］涂良珍,杨学磊,张 斌,等.病毒性心肌炎的病原学诊断及临床分析[J].心血管康复医学杂志,2002,11(4):337.