糖尿病合并冠心病患者血小板表面受体FcγRⅡA和CD40配体的表达水平

作者：李忠艳，曲 鹏，朱 宁    作者单位：教育部留学归国人员科研启动基金（教外司留［2007］24号）大连医科大学附属第二医院心血管内科，辽宁 大连 116027         【摘要】  目的：探讨2型糖尿病(2-DM)合并冠心病(CHD)病人血小板表面受体FcγRⅡA(CD32)和CD40配体（CD40L）的表达水平及二者的相关性。方法：选择单纯CHD患者36例(Ⅰ组)、单纯2-DM患者35例(Ⅱ组)、2-DM合并CHD患者33例(Ⅲ组)及正常对照者30名(正常对照组)，采用流式细胞术分别检测其血小板表面FcγRⅡA和CD40L的表达水平,并将二者作相关分析。结果：Ⅲ组血小板FcγRⅡA和CD40L水平较对照组、Ⅰ组及Ⅱ组均显著升高（P<0.05～<0.01）,血小板表面FcγRⅡA和CD40L的表达水平呈正相关(r = 0.374,P<0.05)。结论：2-DM合并CHD患者的血小板表面FcγRⅡA和CD40L表达水平明显升高,二者呈明显正相关。血小板表面FcγRⅡA和CD40L的表达水平可能是反映糖尿病患者合并冠状动脉粥样硬化的有用指标。

        【关键词】  受体，Fc；CD40配体；冠状动脉疾病；糖尿病，2型

        Analysis of platelet surface expression FcγRⅡA and CD40L in type 2 diabetes mellitus patients with coronary heart disease/LI Zhongyan, QU Peng, ZHU Ning//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009,18(2):96

        Abstract：Objective:To determine the platelet surface expression of Fc gamma RⅡA(FcγRⅡA,CD32）  and CD40L in patients with type 2 diabetes mellitus（2-DM） and coronary heart disease（CHD）and to explore the relationship between them.Methods:The platelet surface expression of FcγRⅡA and CD40L were measured by flow cytometry at fasting state in 104 consecutive patients，including 36 patients with CHD (GroupⅠ),35 patients with 2-DM without CHD (GroupⅡ)，and 33 patients with 2-DM and CHD(GroupⅢ).The 30 subjects were served as a control group．The correlation between platelet FcγRⅡA and CD40L were investigated.Results:Platelet surface expression of FcγRⅡA and CD40L were significantly higher in Group Ⅲ than those in control group, GroupⅠand GroupⅡ(P<0.05～<0.01)．The level of platelet FcγRⅡA was positively correlated with the level of platelet CD40L (r=0.374，P<0.05). Conclusion:Platelet surface expression of FcγRⅡA and CD40L，may be useful markers for predicting the presence of coronary atherosclerosis in patients with type 2 diabetes．

        Author′s　address：Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian，Liaoning，116027，China

        Key words：Receptors,Fc;CD40 ligand;  Coronary artery disease; Diabetes mellitus,type 2

        糖尿病(DM)是冠心病(CHD)的等危症,其10年内发生心血管事件的危险较非DM患者高5～10倍,这两种疾病具有多个共同的危险因素,如胰岛素抵抗等。近年研究揭示血小板活性的改变、炎症反应在糖尿病患者的病情发展及血栓性并发症的发生中起着一定作用[1]。众所周知，胶原是血管内皮细胞外基质的重要组份，不仅支持血小板粘附，而且是血小板活化的强诱导剂。血小板表面Fc受体γ链 (Fc receptorγ-chain)参与血小板与胶原之间的反应过程[2]。冠心病基础是冠状动脉粥样硬化（AS）及冠脉内的血栓形成，在这一过程中，血小板表面Fc受体FcγRⅡA（Fc gamma RⅡA）起到非常重要的作用[3]。CD40配体(CD40 ligand，CD40L)是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）家族的一种跨膜蛋白质，CD40L作为重要的炎症信号通路的配体，在AS发生、发展中起重要作用。有的研究表明免疫与炎症反应参与了冠心病的AS斑块形成及破裂, CD40L可以诱导细胞黏附,趋化因子形成,诱导细胞外基质降解,引发血小板的活化[4],抗CD40L抗体可以减少急性冠脉事件的发生。本研究主要对单纯CHD患者及2型糖尿病(2-DM)有或无合并CHD患者的血小板表面FcγRⅡA和CD40L的表达水平进行检测，并作相关分析。

        1  资料与方法

        1.1  一般资料

        住院患者104例,均接受冠状动脉造影检查，根据是否患有2-DM(空腹血糖水平>7.0 mmol/L或餐后2 h血糖水平>11.1 mmol/L，或服用降糖药物，或接受胰岛素治疗,排除继发性糖尿病及Ⅰ型糖尿病）患者被分为3组：Ⅰ组，CHD患者36例，其空腹血糖水平≤5.6 mmo1/L;Ⅱ组,2-DM患者35例，冠状动脉造影结果正常；Ⅲ组,2-DM合并CHD患者33例。另选择30名作为正常对照组，其既往史及体检，心电图，胸片，心脏超声检查及肝、肾功能，血糖等生化指标均经检测分析，确诊无DM及CHD。采集所有入选对象的有关临床资料，剔除有急、慢性病毒或细菌感染史、免疫系统异常或肿瘤病史的患者。

        1.2  方法

        血小板表面FcγRⅡA和CD40L表达水平的检测：所有患者空腹12 h后于清晨采取肘静脉血2 ml，抗凝，取0.1 ml新鲜血用 1∶50磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，分别与荧光标记的单克隆抗体CD32-异硫氰酸荧光素（FITC）（Biozol, 德国）、CD40L-FITC（Calbiochem, 德国）室温避光孵育60 min后，采用美国BD公司FACS Calibur 型流式细胞仪分析，测定血小板表面FcγRⅡA和CD40L的平均荧光强度（MFI），用CELLQuest软件获取结果。

        1.3  统计学方法

        采用SPSS 11.0统计学软件包进行统计分析，计数资料以例数与百分比表示，采用x2检验；计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验, 以Pearson相关方程计算变量间关系。P<0.05为差异有显著性。

        2  结  果

        2.1  基线特征

        各组间年龄、男女比例没有显著差异,在三组患者中，血小板数大致相同,主要危险因素在三组间没有明显差别。见表1。表1  对照组和疾病组基础临床资料

        2.2  各组血小板表面FcγRⅡA和CD40L表达水平

        Ⅲ组的血小板表面FcγRⅡA和CD40L的表达水平显著高于Ⅱ组、Ⅰ组和正常对照组（P<0.05～<0.01）；Ⅱ组、Ⅰ组的以上指标亦显著高于正常对照组(P<0.01)。见表2。表2  各组血小板表面FcγRⅡA和CD40L表达水平注：与对照组比较△△P<0.01；与Ⅰ组比较▲P<0.05；与Ⅱ组比较##P<0.01。

        2.3  血小板表面Fc受体FcγRⅡA和CD40L表达水平的相关性分析

        血小板表面Fc受体FcγRⅡA和CD40L的表达水平呈明显正相关(r=0.374, P<0.05)。

        3  讨  论

        DM是一种慢性代谢性疾病,除葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱外尚有血小板功能变化及凝血纤溶系统功能的紊乱,可导致各种并发症尤其是血管并发症的出现。有报道认为DM患者的血小板活性与其血管并发症的发生发展相关,与患者病情的控制好坏相关。故研究DM患者的血小板功能变化有一定的临床意义。

        血小板的活化及炎症反应在AS的发生、发展中起重要作用。血小板的活性增强不但参与粥样斑块的形成,还参与斑块的破裂,促进血管内血栓的形成。动物实验表明,抑制血小板与动脉管壁的粘附,可以减少AS的发生和发展。胶原是细胞外基质的主要成分，在血小板与动脉管壁的粘附中起重要作用，这一过程是通过血小板Fc受体γ链与糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）组成的复合物发挥作用的。在血小板膜上，GPⅥ与Fc受体γ链以复合物形式存在，两者在结构和功能上密切相关。GPⅥ跨膜区的精氨酸与Fc受体γ链跨膜区的天冬氨酸以盐键的形式非共价连接[5]。将GPⅥ和Fc受体γ链基因共转染K562细胞，后者表达这两种蛋白并重建对胶原的粘附和细胞内磷酸化反应；如仅转染GPⅥ基因，则细胞对胶原的上述反应消失[6]。Fc受体γ链缺陷小鼠,因血小板不能表达Fc受体γ链,GPⅥ也不能表达,不能对胶原刺激产生反应[2]。提示这两种蛋白分子在血小板膜表面定位和功能发挥上密切相关。Fc受体γ链以二聚体形式存在,其胞内区肽链含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该基序中的酪氨酸发生磷酸化后募集并活化其他信号转导分子,从而发生有序的胞内信号转导,产生生物效应,引起血小板的活化和分泌[6,7]。胶原介导的血小板活性增强可引起动脉硬化及动脉血栓形成,在这一过程中,FcγRⅡA起到关键性的作用[3,8]，作者在国外的研究及其他学者均发现DM病人血小板FcγRⅡA的表达增强[9，10])。但血小板FcγRⅡA在DM合并CHD病人的表达情况尚未见报道。本研究结果显示, DM合并CHD病人血小板FcγRⅡA的表达水平明显高于单纯DM及单纯CHD组和正常对照组(P<0.05～<0.01)，单纯DM及单纯CHD病人血小板Fc受体FcγRⅡA的表达水平也明显高于正常对照组,可见,随着DM病人冠脉病变的出现，血小板Fc受体FcγRⅡA表达增加，其监测有可能成为预测DM病人合并冠状动脉粥样硬化的重要指标。

        CD40 L 存在于血小板及T淋巴细胞表面,可与B淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞的CD 40相结合产生一系列炎症反应。目前认为CD40L是各种免疫炎症反应调节的信号通路,参与AS斑块内主要细胞成分的炎症反应调节[11]。CD40L能诱导巨噬细胞表达组织因子,是炎症反应、粥样斑块不稳定的基础。若阻断CD40L,可以减缓斑块的发展,使其结构特征趋于稳定。CD40L还可通过调节粥样斑块内金属蛋白酶的表达,降解细胞外基质,减弱粥样斑块稳定性[12]。另外,CD40L调节的机体免疫反应信号通路,可能刺激血管内皮细胞,巨噬细胞,血管平滑肌细胞产生与AS有关的生物活性因子,如选择素、细胞因子等,使之在组织中表达增强。CD40L越高,AS危险性越大。因此, CD40L是心脏事件的危险因子,也是识别AS斑块和血栓形成的外周血标志物。

        有文献报道在急性冠状动脉综合征患者中CD40L水平升高[13]，与本研究中DM患者的情况相似,故DM患者血小板活化与其冠状动脉的并发症相关。2型DM患者由于在疾病过程中存在血管内皮细胞受损、脂质过氧化等原因,可导致血小板激活。患者的高血糖状态本身也可导致血小板活化,血小板被激活后其凝血活性增高,表现在其聚集功能增强、细胞表面α-颗粒膜蛋白表达量增多等。

        在本研究中2-DM合并CHD患者血小板FcγRⅡA及CD40L增高（P均<0.01），并且通过直线相关分析发现血小板FcγRⅡA与CD 40 L的表达水平呈明显正相关，说明二者都参与了冠脉斑块的形成,对于AS发病相互促进。以上结果反映2型DM患者体内存在着血小板的活化及炎症反应,血小板激活在DM患者的病情发展、并发症的发生方面起一定的作用。对DM患者进行抗血小板功能药物的治疗以降低血小板活化程度,有助于DM病情的控制并可预防其冠状动脉粥样硬化的发生。

        总之，血小板FcγRⅡA和CD40L水平可能是反映DM病人并发冠状动脉粥样硬化的有用指标,对于DM未来风险预测具一定价值。但目前针对血小板FcγRⅡA的研究不多，具体的机制尚有待于进一步研究和验证。

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