炎症细胞因子对人脐静脉内皮细胞分泌VEGF、ICAM-1的影响

作者：张清华，陈玲，蒋知新，陈士良，王小冬，张金萍    作者单位：全军医药卫生“十五”计划重点课题（04LX048）；全军医药卫生“十一五”计划科技攻关课题（06G144）1.中国人民解放军第305医院,北京市 100017；2.南方医科大学研究生学院         【摘要】  目的：探讨炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分泌血管内皮生长因子（VEGF）、细胞间粘附分子1（ICAM-1）的影响。方法：人脐静脉内皮细胞在37℃、5％CO2的条件下常规培养，实验采用4～5代细胞；按1×105/ml密度接种于5 cm2的培养皿中，24 h后换液，生长接近80％融合时进行干预。按IL-1β组、TNF-α组、IL-1β+TNF-α组、空白对照组进行刺激（IL-1β和TNFα干预浓度均为10 ng/ml），每组12个样本；在共同培养24 h后收集细胞上清液。应用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞上清液中VEGF、ICAM-1的浓度。结果：IL-1β组、TNF-α组、IL-1β+TNF-α组的VEGF值（ng／ml）分别为（27.91±0.63）、（13.54±1.17）和（13.05±0.11），均明显高于对照组（4.21±0.91），P=0.000；IL-1β组、TNF-α组、IL-1β+TNF-α组的ICAM-1值（ng／ml）分别为（2.88±0.98）、（2.96±0.03）和（2.30±0.20），均明显高于空白对照组（0.25±0.01），P=0.000。结论：炎症因子IL-1β、TNF-α均可促进人脐静脉内皮细胞分泌斑块不稳定相关标志物 VEGF、ICAM-1，可能是炎症在急性冠脉综合征的发生、发展中起重要作用的机制之一。

        【关键词】  白细胞介素1；肿瘤坏死因子α；血管内皮生长因子；细胞粘附分子

        Effects of inflammatory cytokine on secretions of VEGF and ICAM-1 in human umbilical vein endothelial cells/ZHANG Qing|hua,CHEN Ling,JlANG Zhi|xin,CHEN Shi|liang,WANG Xiao|dong,ZHANG Jin|ping//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009，18（2）:93

        Abstract：Objective:To observe the effect of interleukin-1β(IL-1β)  and tumor necrosis factor-α(TNF-α)  on secretions of vascular endothelial growth factor(VEGF)  and intercellular adhesion molecule-l(ICAM-1) in human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）. Methods:HUVECS were incubated in a 37℃, 5% CO2air.Cells of the fourth to fifth passage were used for experiments, seeded at 1×105 cells/ml per 5 cm2 tissue culture flasks;change the medium 24 h after establishing the subculture.When cells reached 80% confluence, the following treatment would be done:After 24 h exposure to different inflammatory cytokines, serum VEGF and ICAM-1 were determined by enzyme|linked immunosorbent assay(ELISA) in control group, IL-1β group, TNF-α group, IL-lβ+TNF-α group.The concentration of  IL-lβ and TNF-α was 10 ng/ml.Results:ELISA analysis showed that the concentration of VEGF in  IL-lβ,TNF-α and IL-lβ+TNF-α groups were (27.91±0.63),(13.54±1.17) and (13.05±0.11)ng/ml respective1y;whereas the concentration of VEGF of the control group was (4.21±0.91)ng/ml. There were significant differences between all the experimental groups and the control group (P=0.000). The concentration of ICAM-1 in IL-lβ,TNF-α and IL-lβ+TNF-α groups were (2.88±0.98),(2.96±0.03) and (2.30±0.20)ng/ml respectively; whereas the concentration of ICAM-1 of the control group was (0.25±0.01)ng/ml. There were significant differences between all the experimental groups and the control group (P=0.000).Conclusion: IL-lβ and TNF-α can induce the HUVECS production of VEGF and ICAM-1, suggesting that inflammation may play an important role in the development of acute coronary syndromes.

        Author′s　address：Chinese People′s Liberation Army 305th Hospital,Beijing,100017,China Key words：Interleukin-1;Tumor necrosis factoralpha;Vascular endothelial growth factor;Cell adhesion molecules

        研究表明，冠状动脉粥样硬化斑块的不稳定是冠脉脉综合征（ACS）发生的基础。急性炎症反应是促进冠脉粥样斑块不稳定的重要因素，因而对于ACS的发生发展有重要作用。最近越来越多的研究表明血管内皮生长因子（VEGF）可通过炎症浸润和新生血管形成等机制促进动脉粥样硬化 （AS）损伤的进展，与斑块的不稳定性有密切关系。研究也显示在 AS 早期病灶中已有细胞粘附分子（ICAM）-1的表达，而且该表达受病理生理状态、代谢产物、细胞因子等多种因素调控［1，2］。ICAM-1在活性内皮细胞上的表达是循环白细胞聚集浸润引起一定部件组织损伤和炎症反应的关键。本研究采用炎症因子白细胞介素（IL）-lβ、肿瘤坏死因子（TNF）-α刺激人脐静脉内皮细胞，观察其中VEGF、ICAM-1表达的变化，从而探讨炎症因素在ACS中的作用机制。

        1  资料与方法

        1.1  实验材料

        1.1.1  细胞：人脐静脉内皮细胞（HUVEC，由武汉大学细胞库提供）。

        1.1.2  试剂：1640培养基、培养基添加剂及胰蛋白酶（Casecade公司）， IL-lβ、TNF-α（PeProtech公司），M-MLV逆转录酶、TRIZOL 试剂（Invitroge，USA），三氯甲烷、异而醇、无水乙醇（北京北化精细化学品有限责任公司），溴化乙锭（Sgma，USA），VEGF含量ELISA测定试剂盒、ICAM-1含量ELISA测定试剂盒（武汉博士德有限公司）。

        1.1.3  实验仪器：MCO-17AI CO2恒温培养箱（SANYO，Japan）、CK2型倒置显微镜（Olympus，Japan）、细胞超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）、Amicon Ultra-4超滤器（北京欣经科生物技术有限公司）、离心机（Biofuge，德国）、Flextek 2型全自动酶标仪（荷兰阿克苏诺贝尔公司），水浴箱（北京市北方照明电器材公司）。

        1.2  方法

        1.2.1  细胞培养：复苏HUVEC，37℃、95％空气和 5％CO2的培养箱中培养复苏后的 HUVEC，然后传代至第 4～5代细胞。将细胞按 l×105／ml接种于 5 cm2的培养皿内，24 h后换液，在细胞接近 80%融合时加入炎症因子。按10ng／ml IL-lβ、10 ng/ml TNF-α、10 ng/ml IL-lβ+10 ng/ml TNF-α、空白对照进行刺激，每组12个样本；24 h后收集细胞上清液。

        1.2.2  应用ELISA试剂盒检测：采用305医院检验科Flextek 2型全自动酶标仪进行，试验前按照试剂盒的步骤编好程序，并进行预试验（检测VEGF时细胞上清液按1∶100稀释；检测ICAM-1时细胞上清液按1∶10稀释）。操作时分步进行部，孵育前盖上微孔板盖板条，完成孵育后揭下，每次洗板后暂停程序，将微孔板拿出并拍板，以吸水纸吸净剩余液体。

        1.2.3  数据处理：设样品浓度为x轴，光密度（OD）值为y轴，以试剂盒内标准品和质控所得出的OD值以及其原始浓度按照线性回归的方式绘制标准曲线，根据仪器所读出的各个样品的OD值，对应地找出其浓度，并乘以稀释的倍数，得出原始数据。

        1.3  统计学方法

        所得数据应用SPSS 13.0对软件进行统计学描述与分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组间均数的比较用完全随机的方差分析检验，两两比较应由最小差异法（LSD）检验，P<0.05为差异有显著性。

        2  结  果

        2.1  VEGF、ICAM-1表达的情况

        测得试剂盒所提供的标准品的OD值梯度明显，应用 SPSS 13.0软件所作标准曲线规整，没有异常点，认为所测VEGF、ICAM-1浓度准确可信。实验四组间VEGF值比较差异有显著性（F=3774.8，P=0.000）；四组间ICAM-1值比较差异亦有显著性（F=1320.1，P=0.000），见表1、图1。表1  IL-lβ、TNF-α对人脐静脉内皮细胞分泌VEGF、ICAM-1的影响注：IL-lβ：白细胞介素-1β，TNF-α：肿瘤坏死因子-α，VEGF：血管内皮生长因子，ICAM-1：细胞间粘附分子-1。与对照组比较△P<0.05；与 IL-lβ组比较▲P<0.05；与 IL-lβ+TNF-α组比较#P<0.05。

        2.2  炎症因子组与对照组的VEGF水平

        VEGF浓度在炎症因子组（包括 IL-lβ组、TNF-α组和 IL-lβ+TNF-α组）较正常对照组明显升高（P<0.05）； IL-lβ组的明显高于 TNF-α组及 IL-lβ+TNF-α组（P<0.05）；虽然 TNF-α组的较 IL-lβ+TNF-α组稍高，但差异无显著性（P>0.05）。

        2.3  炎症因子组与对照组 ICAM-1水平

        ICAM-1浓度在炎症因子组（包括 IL-lβ组、TNF-α组和 IL-lβ+TNF-α组）较正常对照组明显升高（P<0.05）。 IL-lβ组及TNF-α组的明显高于 IL-lβ+TNF-α组（P<0.05）；虽然TNF-α组的较IL-lβ组稍高，但差异无显著性（P＞0.05）。

        3  讨  论

        AS斑块糜烂与破裂几乎总是与炎症并存［3］。不稳定的粥样斑块内有许多激活的T淋巴细胞、泡沫细胞、巨噬细胞和肥大细胞；这些炎症细胞可以分泌大量的炎症因子，如IL-lβ、TNF-α等，它们可影响细胞外基质胶原的合成。Oda等［4］研究了细胞基因影响AS的发生发展，IL-lβ的511T基因和TNF-α的+29T基因是锁骨下动脉和颅内动脉AS形成的重要危险因素。临床研究表明［5］不稳定性心绞痛（UAP）病人血清IL-lβ水平明显高于稳定性心绞痛（SAP）病人及对照组。同时实验证明高浓度的TNF-α加速AS的发生发展，ACS组外周血TNF-α水平明显高于对照组。以上研究结果说明，IL-lβ、TNF-α在ACS的发生发展过程中起了重要的作用。

        VEGF是迄今发现的公认的具有特异性，促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，已证明在AS斑块中的表达明显增加，并可能促进斑块的发生与发展。血管新生也是炎症反应的重要特征。最近有学者［6，7］证明，斑块内血管生成主要与斑块内炎性细胞聚集程度有关，而不是与斑块的厚度相关，以上均证明血管生成与炎性反应有关。新生血管内皮上常有高水平的粘附分子［血管细胞粘附分子（VCAM-1）、细胞间粘附分子（ICAM-1）和 E-选择素］表达，这些高表达的粘附分子是单核-巨噬细胞向病变部位迁移的重要的调节因素。在AS血管的内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞均有大量而持久的ICAM-1的表达。某些炎症因子如IL-lβ和TNF-α可直接或通过促进 VEGF表达影响血管新生，进而有可能影响 AS进程。目前关于IL-lβ和TNF-α对VEGF表达影响的体外实验报道很多［8，9］，但多集中于血管以外的细胞，虽然IL-lβ和TNF-α对于血管内皮细胞的直接作用是导致其损伤，理论上似抑制血管新生，但本研究结果提示IL-lβ和TNF-α促进 VEGF表达，这和已有的绝大多数研究结果是一致的。同时结果显示IL-lβ组的VEGF值均显著高于TNF-α组和IL-lβ+TNF-α组。VEGF具有特异性促进血管新生的作用，而血管新生又可促进AS的进程，使薄壁的滋养血管很容易破裂，造成斑块内出血，进而形成血栓，引发UAP、心肌梗塞等严重心血管事件。IL-lβ和TNF-α除直接导致血管内皮细胞损伤外，还可通过促进粘附分子的表达，促进白细胞、单核细胞和淋巴细胞等与血管内皮细胞的粘附、迁移，加速AS的进程，本研究结果提示IL-lβ和TNF-α促进HUMEC中ICAM-1的表达，这也和绝大多数研究的结果是一致的［10，11］。

        总之，本研究结果提示，炎症因子IL-lβ、TNF-α可以刺激 HUVEC分泌 VEGF、ICAM-1增加，进一步证明了炎症可能是ACS发生的重要原因，是ACS发生的机制，为其治疗和预防提供新的思路和依据。但本研究只是体外简单的炎症反应细胞模型，其结论的验证有待进一步研究。

        【参考文献】        ［1］Kim I，Moon SO，Kim SH，et al.Vascular endothelial growth factor expression of intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1），vascular celladheslon molecule-1（VCAM-1），and E-selection through nuclear factor-kB activation in endothelial cells［J］.J Biol Chem,2001,276（10）：614-620.

        ［2］Kim I，Moon SO，Park SK，et al.Angiopoietin-1 reduces VEGF|stimulated leukocyte adhesion to endothelial cells by reducing ICAM-1，VCAM-1,and E|selection expression［J］.Circ Res，2001，89（6）：4772-479.

        ［3］丁士芳，张 运，张 梅，等.斑块稳定性与炎症反应在急性冠状动脉综合征中作用的研究［J］.中华心血管病杂志，2006，34（6）：512-515.

        ［4］Oda K,Tanaka N,Aral T,et al.Polymorphisms in pro|and anti|inflammatory cytokine genes and susceptibility to atherosclerosis：a pathological study of 503 consecutive autopsy cases［J］.Hum Mol Genet，2007，16（6）：592-599.

        ［5］Oyama J，Shimokawa H,Morlta S,et al.Elevated interleukin-1 beta inpericardial fluid of patients with ischemic heart disease［J］.Coronary Artery Dis,2001,12(7):567-571.

        ［6］Moulton K，Vakin K，Zurakowski D，et al.Inhibition of plaque neovascularization reduces macrophage accumulation and progression of advanced atherosclerosis［J］.Proc Nail Acad Sci USA,2003，100（8）： 4736-4741.

        ［7］Hayden MR，Tyagi SC.Vasa vasorum in plaque angiogenesis，metabolic syndrome，type 2 diabetes mellitus, and theroscleropathy：a malignant transformation［J］.Cardiovasc Diabeto,2004,3（1）：1.

        ［8］Wilson SH，Herrmann J，Lerman LO，et al.Simvastatin preserves the structure of coronary adventitial vasa vasorun in experimental hypercholesterolemia independent of lipid lowering［J］. Circulation，2002,105（4）：415-420.

        ［9］张 路，吴宗贵.辛伐他汀对家兔主动脉粥样硬化斑块血管内皮生长因子表达的影响［J］.第二军医大学学报，2004，25（5）：560-562.

        ［10］Chen W,Lee JY,Hsieh WC.Effects of dexamethasone and sex homous on cytokine|induced cellular adhesion molecule expression in human endothelial cells［J］.Eu J Dematol，2002,12（5）：445-448.

        ［11］Raab M,Daxecker H,Kanmi A，et al.In vitro effects of mycophenolic acid on the mucieotide pool and on the expression of adhesion molecules of human umbilical vein endothelial cells［J］. Clinchim Acta,2001,301（l）：89-98.