LTA 804C/A基因变异与冠心病易感性、严重度和分子标志物之间的关系

LTA 804C/A基因变异与冠心病易感性、严重度和分子标志物之间的关系作者：赵文强，王 俊，谢红珍，欧阳星文，王士强，陈 辉，吴艳君    作者单位：江苏大学第四附属医院心内科，镇江 212003    【摘要】  目的 研究淋巴毒素α（LTA）804C/A基因变异与冠心病（CHD）易感性、病变严重度和分子标志物之间的关系。方法 用聚合酶链反应序列特异性扩增技术（PCRSSP）对184例CHD患者和118例对照组( CTL)分别检测LTA 804位点基因型、等位基因及其分布频率；用冠状动脉造影测试病变血管支数（DVN）和狭窄程度积分（SSI）；用ELISA法和散射比浊法测试血浆LTA、血管细胞黏附分子1（VCAM1）和C反应蛋白（CRP）水平；分析LTA基因变异与CHD易感风险、DVN、SSI、血浆LTA、CRP、VCAM1水平之间的关系。结果 LTA 804C/A变异与CHD患病风险显著关联（AA+CA基因型OR=1.47，A等位基因OR=1.54，均P＜0.05），AA基因型和A等位基因的频率在CHD组比CTL组显著增高（均P＜0.01）；804位点变异型（AA+CA）比野生型（CC）的DVN、SSI、VCAM1及CRP显著增高（P均＜0.05）；但血浆LTA无显著变化。结论 LTA 804CA基因变异可能是CHD患病的易感基因型，且与冠状动脉病变程度和炎性细胞因子过度表达有关，但与LTA转录无关。    【关键词】  冠状动脉粥样硬化性心脏病； 基因型； 单核苷酸多态性； 聚合酶链反应； 淋巴毒素α    Association between genetic variation of lymphotoxinα 804C/A and susceptibility, lesion severity and molecular makers of coronary heart disease    ZHAO Wenqiang, WANG Jun, XIE Hongzhen, OUYANG Xingwen, WANG Shiqiang, CHEN Hui, WU Yanjun. Department of Cardiology, Fourth Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212003, China    Abstract：Objective  To investigate association between genetic variation of lymphotoxinα (LTA) 804C/A and susceptibility, lesion severity and molecular makers of coronary hcart disease (CHD).   Methods  Sequence specific primerspolymerase chain reaction (PCRSSP) was used for the detection of genotypes and alleles in LTA 804 locus in 184 CHD patients and 118 controls. Diseased vessel numbers (DVN) and stenotic severity integral (SSI) by coronary angiography and serum levels of LTA, vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) and Creactive protein (CRP) were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and nephelometry. Association between LTA gene variants and CHD risk, DVN，SSI as well as plasma levels of LTA, VCAM1 and CRP were analyzed.   Results  LTA 804 C/A variant was significantly associated with CHD (OR=1.47 in genotype AA+CA, OR=1.54 in A allele, all P＜0.05). Frequency of AA genotype and A allele in CHD group was significantly higher compared to control group (both P＜0.01). Patients with (AA+CA) genotype had significantly higher DVN，SSI, CRP and VCAM1 levels than wild type (CC)，but there was no significant difference of plasma LTA level between AA+CA genotype and CC genotype.   Conclusions  LTA 804C/A variant may be a genetic predictor of CHD. It is associated with severity of coronary lesion and overexpression of inflammatory cytokines, but not associated with transcriptional level of LTA .      Key words：  Coronary atherosclerosis heart disease;  Genotype;  Single nuclear polymorphism;  Polymerase chain reaction;  Lymphotoxinα    冠心病（coronary heart disease, CHD）是由多基因位点突变或多基因组功能变异引起的慢性闭塞性冠状动脉粥样硬化疾病。探索风险基因型与CHD易感性之间的关系对阐明发病分子机制和基因治疗途径具有指导意义。淋巴毒素α（lymphotoxinα，LTA）基因是位于6p21号染色体、编码淋巴毒素α、促进某些炎性细胞因子转录和释放的基因，最近日本作者发现其第三外显子（exon3）804C/A变异与心肌梗死（myocardial infarction, MI）发病风险有显著关联[1]，但西方国家报道与此存在差异[2] 。本文报道江苏汉族184例CHD和118例对照组（control, CTL）LTA基因型、等位基因与CHD易患风险、冠状动脉病变程度和3个炎性细胞因子变化之间的关系。1  对象和方法    1.1  研究对象    选自2005年至2007年在我院住院行冠状动脉造影资料完整患者，设CHD组（184例，男120例，女64例），平均年龄(64.3±11.1)岁，急性心肌梗死45例，不稳定心绞痛139例；对照组（118例，男78例，女40例），平均年龄(62.2±10.5)岁，均为冠状动脉造影正常者。两组年龄、性别、主要危险因素（高血压、糖尿病、高血脂等）无显著差异；所有研究对象均无血缘关系。    1.2  研究方法    1.2.1  冠状动脉造影  对每例患者记录如下指标：(1)病变血管支数：分0支组、＜3支组、≥3支组，分别记录各组的例数；(2)狭窄程度积分（stenostic severity integral, SSI）：采用各狭窄段直径狭窄百分比（percent diameter stenosis, PDS）与长度（length, L）乘积的总和，按SSI=∑（PDS×L）n（mm）。    1.2.2  DNA提取  抽动脉血2 ml置于EDTA K2试管中，用全血基因组DNA提取试剂盒（上海生工公司）以离心柱法提取基因组DNA，置4 ℃储藏待测。    1.2.3  引物设计  按聚合酶链反应序列特异性扩增技术（squence specific primers polymerase chain reaction, PCRSSP）方案要求自行设计5条引物，送上海生工公司合成。P1： 5′CCG TGC TTC GTG CTT TGG ACT A3′，作公共引物； P2：5′G GTG AGC AGC AGG TTT GAG GG3′， P3：5′G GTG AGC AGC AGG TTT GAG GT3′；P2、P3分别为对应804位点的两个等位基因（C/A）的序列特异性引物，分别与P1配对构成两套引物对，扩增693 bp长的产物片段。P4：5′GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC3′； P5：5′CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC3′，P4、P5为扩增β珠蛋白基因234片段长的产物，在PCR时作内对照用。    1.2.4  PCR扩增  （1)试剂与设备：Taq DNA聚合酶试剂盒购自上海生工公司，使用美国PTC200梯度基因热循环仪、意大利BIORAD GIEI DOC2000型紫外凝光图像分析系统等设备。(2)PCR扩增：采用PCRSSP技术：扩增体系25 μl，P1、P2或P3各5 μmol/L，对照引物2 μmol/L，dNTP 0.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U，10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，双蒸水加至25 μl。扩增条件：采用Touch down循环法：95 ℃ 15 min，95℃30 min，70 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，5个循环；95℃ 30 s，69.5℃ 1 min (每一循环减0.5℃)，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物经溴化乙淀染色、2%琼脂凝胶电泳、紫外凝光仪下观察结果。(3)基因型判断：按电泳图DNA碱基条带分布判断基因型。    1.2.5  细胞因子测定  对每例受试者用日本BIORAD 550型酶标分析仪以ELISA法测量血浆LTA和血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule1, VCAM1）水平，用散射比浊法测试血浆C反应蛋白（Creaction protein, CRP）。LTA试剂盒和VCAM1试剂盒购自上海晶美公司。    1.3  统计学处理    采用SPSS12.0软件包处理，用基因计数法计算各组基因型频率、等位基因频率=[（2×纯合子数+杂合子数）/（2×受检人数）]、各型CHD风险的优势比（odds ratio, OR）；并根据要求采用χ2检验、配伍组t检验。对研究对象与HardyWeinberd平衡的吻合程度采用χ2检验。以P＜0.05认为差异有统计学意义。2  结果    2.1  基因电泳图    LTA804C/A位点检测到3种基因型：CC型、CA型、AA型。凡P2P1引物对扩增出693bp条带而P3P1引物对扩不出条带的被判断为CC型，P3P1引物对扩增出693bp条带而P2P1引物对扩不出条带的为AA型，两引物对均能扩出693bp条带的为CA型（杂合子）。    2.2  基因型变异与CHD罹患风险    研究对象经检验符合HardyWeinberd平衡；804位点AA型和A等位基因的CHD易感风险比野生型增大1.47和1.54倍（P＜0.05）；冠心病组AA基因型和A等位基因的频率比对照组显著增大（P＜0.05），见表1。    2.3  基因型与冠状动脉病变程度    804位点CA+AA型比CC型DVN和SSI均有显著增加（P＜0.01），见表2。 表1  冠心病组与对照组LTA 804 位点基因型频率、等位基因频率和易感风险对比注：基因型频率的OR值为AA+CA与CC比较；等位基因频率的OR值为A与C比较表2  基因变异型与野生型的血管病变支数和 狭窄程度积分的比较注：与CC比较， a P＜0.01    2.4  基因型变异与炎性细胞因子    804位点CA+AA比CC型血浆CRP、VCAM1水平均显著增高（P均＜0.01），但LTA变化差异无统计学意义，见表3。表3  不同基因型血浆LTA、CRP、ICAM1水平的比较 注：与CC比较， a P＜0.013  讨论    LTA基因属肿瘤坏死因子β家族的编码基因，研究表明，LTA基因含4个外显子和3个内含子，5个重要的多态性位点。804位点C→A变异造成26号氨基酸错义突变（苏氨酸→门冬酰胺），引起基因或基因组对炎症、免疫反应、血脂代谢和血管内膜防护功能调控异常。国外多数报道804C/A多态性与冠心病风险增强有关，但不同种族组群差异较大[14 ]。LTA作为1级促炎性细胞因子与白细胞、内皮细胞和平滑肌表面受体结合促进2级炎性细胞因子（TNFα、ICAM1、VCAM1、IL6等）的释放，在血管斑块破裂和AMI触发中迅速引发炎性瀑布，激活血小板引发血栓事件。据报道LTA促进ICAM1释放的强度是TNFα的2.5倍，在AMI发作时血浆水平较对照组有数倍的升高，是目前所知的最强的致炎因子和促动脉粥样硬化因子之一，但LTA基因通过何种机制调控LTA转录和其他炎症因子表达尚未完全阐明。    3.1  LTA 804C/A基因变异与CHD罹患风险之间的关系    日本学者Ozaki等[1]对1133例MI和1006例对照研究表明，LTA基因exon3 804C/A 多态性显著与MI易感高风险有关（OR=1.78），而日本另组研究（1891例MI和1798例对照组）和德国报道MI对照研究未发现两者存在显著联系[3]。但欧洲群族研究发现，exon3 804C/A多态性与欧洲白人3人之家冠心病易感性显著相关，其变异型（AA）比野生型（CC）的MI发病率显著增高1.76倍[5]；美国对LTA基因临近区5个位点联合单倍型研究发现，单倍型A与MI易感性显著相关。对中国人汉族研究结果基本与此相近：804C→A与CHD易患风险显著相关，与多数作者结果相近；804AA基因型和A等位基因CHD发病风险比野生型增高1.47和1.54倍；提示LTA 804 AA基因型和A等位基因可能是CHD发病的易感基因型。    3.2  LTA基因变异与冠状动脉病变程度之间的关系    英国Laxton等[6]研究证实，804C/A变异造成Thr26Asn的错义突变使得多支（≥3支）血管病变的发生率显著增高，Asn/Asn基因型多支病变风险增加1.98倍；本文804AA型≥3支冠状动脉病变频率和SSI比野生型显著增加；与此结果相近。动物实验表明，小鼠动脉粥样硬化斑块中可见LTA的表达，LTA减少可使血管病变的范围缩小，而消除TNF并不能改变病变的进展[7]。剔除LTA变异基因后小鼠血管病变程度和临床表现严重度明显减轻，提示是LTA而不是TNF改变了冠状动脉粥样病变的进程。    3.3  LTA基因变异与炎性细胞因子之间的关系    Ozaki等[1]发现，804C/A多态性增加ICAM1、VCAM1、TNF、IL1A、IL1B和选择素E表达达2倍；美国作者Asseibergs等[8]发现，LTA多态性直接与可溶性肿瘤坏死因子受体和VCAM1水平增高有关；本研究中国人804AA型比CC型血浆VCAM1和CRP显著增高而LTA基本不变；表明804C→A变异可促进VCAM1等炎性细胞因子过度表达、而不干扰LTA转录过程。【参考文献】［1］Ozaki K, Ohnishi Y, Iida A, et al. Functional SNPS in the lymphotoxinα gene that are associated with susceptibility to myocardial infarction［J］. Nature Genetics，2002，32:650654.［2］Clarke R, Xu P, Bennett D, et al. Lymphotoxinα gene and risk of myocardial infarction in 6928 cases and 2712 controls in the ISIS casecontrol study［J］. Plos Genetics，2006，2:09900995. ［3］Wang Q. Molecular genetics of coronary artery disease［J］. Curr Opin Cardiol 2005，20:182188.［4］Mizuno H, Sato H, Sakata Y, et al. Impact of atherosclerosisrelated gene polymorphisms on mortality and recurrent events after myocardial infarction［J］. Atherosclerosis，2006，185:400405.［5］PROCARDIS Consortium. A trio family study showing association of the lymphotoxinalpha N26 (804A) allele with coronary artery disease［J］. Eur J Hum Genet，2004，12:770774. ［6］Laxton R, Pearce E, Kyriakou T, et al. Association of the lymphotoxinalpha gene Thr26Asn polymorphism with severity of coronary atherosclerosis［J］. 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