前癃通胶囊对前列腺基质细胞Caspase3表达的影响

　　作者：朱闽1，贺菊乔2 作者单位：(1.广西中医学院附属瑞康医院 男性科， 广西 南宁530011; 2湖南中医药大学第一附属医院 外科， 湖南 长沙410007)

　　【摘要】 目的： 探讨前癃通胶囊对前列腺基质细胞Caspase3表达的影响。方法： 采用组织细胞培养法，对良性前列腺增生(BPH)患者的前列腺基质细胞进行体外培养;用免疫组织化学法检测前癃通对体外培养的前列腺基质细胞Caspase3表达的影响。 结果： 模型组Caspase3表达缺失，不同剂量的前癃通组对Caspase3表达均明显增强，且对Caspase3表达的增强作用表现出明显的量效关系(组间比较P<0.01)。结论： 前癃通胶囊能增强Caspase3在体外培养BPH前列腺基质细胞中的表达，这可能是前癃通胶囊治疗前列腺增生症的作用机理。

　　【关键词】 胶囊; 前列腺增生; 细胞培养; 酶类

　　[Abstract] Objective:To investigate the effect of Qianlongtong capsule on expression of caspase3 in prostatic stromal cells of patients with benign prostatic hyperplasia (BPH). Methods： Prostate stromal cells of patients with BPH were cultured in vitro. Expression level of caspase3 in prostate stromal cells treated by Qianlongtong capsule were detected with immunohistochemistry method. Results: Different dosages of Qianlongtong capsules increased the expression of caspase3 in a dosedependent manner, and the differences among groups were significant (P<0.01). Conclusion: Qianlongtong capsule can promote the expression of caspase3 in prostate stromal cells of patients with BPH, which may be one of the mechanisms of Qianlongtong capsule to treat BPH.

　　[Key words]capsules; prostatic hyperplasia; cell culture; enzymes

　　良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)是老年男性最常见的疾病之一,研究表明BHP中细胞增殖和凋亡均呈增加趋势，只是凋亡细胞数量的增加远远低于增殖细胞的数量，凋亡处于相对减少的状态[1]。天门冬氨酸特异蛋白酶3(Caspase3)是细胞凋亡的下游关键酶，其表达异常与BPH发生密切相关[2]。因此，干预Caspase3的表达在研究BPH的防治中具有非常重要的意义。前癃通胶囊是贺菊乔教授多年的临床经验方，由黄芪、田三七、丹参、蒲黄、王不留行等药物组成,本实验观察前癃通胶囊对体外培养BPH前列腺基质细胞Caspase3表达的影响,现报告如下。

　　1材料与方法

　　1.1仪器和试剂CO2恒温培养箱(TC2323型、美国Sheloln公司)、电热恒温水箱 (DK600型，上海精宏实验设备有限公司)、超净工作台(苏州安泰空气净化技术公司)、相差倒置显微镜(ECLIPSETE300型、日本Nikon公司)、TGL16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪)、96孔培养板、25 cm2培养瓶(日本Nuco公司出品)及全自动酶标仪(Sunrise,奥地利)。1640基础培养液(美国Gibco公司)、无菌胎牛血清(购于湖南利欣生物公司)、LSAB免疫组化试剂盒(DAKO)及兔抗人多克隆抗体Caspase3(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2实验药物前癃通胶囊由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供，0.5 g/粒(含生药0.5克)，批号000605。他莫昔芬片由山东健康药业有限公司生产，批号1210016，10 mg/片。

　　1.3细胞来源实验细胞培养用的前列腺组织块，取自手术室无菌条件下经耻骨上前列腺摘除术切除的手术标本，每份标本重量2~3 g,经组织学证实为BPH组织。参照文献方法[3，4]进行培养、纯化。培养至第3代细胞，对其进行形态学观察，用内参照半定量逆转录聚合酶链式反应方法(RTPCR)检测平滑肌分化特异性蛋白的表达鉴定其确系基质细胞;用免疫组化法测定平滑肌肌球蛋白的表达阳性率达98%，备用。

　　1.4分组根据实验药物细胞毒性实验结果，选取前癃通高剂量组(6.25 mg/L)、前癃通中剂量组(3.13 mg/L)、前癃通低剂量组(1.56 mg/L)，以1 500 r/min离心去除沉淀，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，4 ℃保存备用;他莫西芬阳性药物对照组，取他莫昔芬20 g，用Hank's液溶解, 用细胞培养液稀释配制成1 mg/L，1 500 r/min离心去除沉淀，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，4 ℃保存备用。同时设空白对照组和模型组。

　　1.5观察指标用免疫组织化学法检测前癃通胶囊对Caspase3表达的影响，选择培养3代的前列腺基质细胞进行细胞爬片(爬片已吸附含多聚赖氨酸)，分别加入含各实验药的细胞培养基(培基不含血清)，同时设模型对照组，48 h后取出爬片，固定，免疫组化法染色(按试剂盒说明书进行)，棕黄色细胞为阳性表达，以图像分析软件分析测定其灰度值。

　　1.6统计学方法结果以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验，用SPSS 13.0软件进行统计分析。

　　2结果

　　模型组细胞核未见棕黄色颗粒(Caspase3表达缺陷)，他莫昔芬组与前癃通各剂量组可见细胞核染色质固缩、细胞全面皱缩及细胞膜皱缩，外突包裹细胞器明显增多，细胞核内棕黄色颗粒(Caspase3表达)均明显增强，前癃通各剂量组之间比较，差异有统计学意义(P<0.01)，呈明显的量效关系;前癃通高、中剂量组与他莫昔芬组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，前癃通高、中剂量组作用强于他莫昔芬组;前癃通低剂量组与他莫昔芬组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，前癃通低剂量组作用弱于他莫昔芬组。结果见表1及图1表1各组前列腺基质细胞Caspase3表达

　　3讨论

　　BPH 是前列腺上皮和基质增生的疾病，以基质增生为主，且其症状与基质和上皮的比例密切相关[5]，基质主要是平滑肌和结缔组织[6]。前列腺增生与细胞调亡失衡密切相关，影响凋亡因子有Bcl2、Bax、Fas、Fas1、ICE、P53、Caspase3及NOS等。Bcl2是一种凋亡抑制因子，在BPH中的表达显著高于正常前列腺组织[7~11]，Bax具有促进细胞凋亡的作用，在BPH中呈低表达，提示BPH的发病与细胞凋亡减少有关[12]。

　　细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是一种基因控制的细胞自主性死亡过程，它是多细胞生物体内的一个重要的生命现象，既出现在个体发育过程中，也出现在正常生理状态或疾病中;既在体内发生，也出现组织体外培养物中，其对维持组织内环境的稳定、细胞群动力性平衡、胚胎发育及成人组织、器官、机体的各种生理功能和病理反应等有重要作用。细胞内发生的与凋亡有关的一系列有序的级联反应，关键是激活了一组被称为Caspase的蛋白酶[13]。有研究表明，与Caspase有关的细胞凋亡通路至少有三条[14]：线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路。目前认为，Caspase3图1各组前列腺基质细胞Caspase3表达(×400)

　　是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，它直接水解激活与DNA断裂等凋亡特性改变密切相关的蛋白，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在细胞凋亡的信号传导途径中大多以激活Caspase3引起细胞死亡而结束。研究表明，Caspase3在BPH上皮表达下降，而在BPH基质中几乎不表达[15]，提示Caspase3表达异常与BPH发生密切相关。

　　他莫西芬是选择性雌激素调节剂，陈斌等[16]研究表明，该药是通过对雌激素的拮抗作用，阻断雌激素在前列腺增生中的作用，从而抑制前列腺增生;付宜鸣等[17]研究表明，他莫西芬的活性代谢物4-羟基他莫西芬在一定浓度范围内，对前列腺基质细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用，因此本研究以该药为阳性对照药。前癃通胶囊是贺菊乔教授应用多年的临床经验方，由黄芪、田三七、丹参、蒲黄、王不留行等药物组成，有益气利水，活血散结之功。本实验设立前癃通低、中、高剂量组，结果表明前癃通胶囊能增强Caspase3在体外培养BPH前列腺基质细胞中的表达，有促凋亡作用，这可能是该药治疗前列腺增生症的机理，该结果对进一步研究凋亡因子对前列腺细胞的影响提供了参考依据。

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