冠心病患者内皮祖细胞与动脉弹性相关性及缬沙坦干预研究

冠心病患者内皮祖细胞与动脉弹性相关性及缬沙坦干预研究作者：陈旭娇，王志军，何 浪    作者单位：（浙江医院心内科，浙江杭州 310006）    【摘要】  目的 探讨冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease, CHD）患者内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPCs）数量及动脉弹性指数之间的相关性，以及缬沙坦干预后EPCs水平和动脉弹性指数变化。方法 冠状动脉造影检查确诊的冠心病患者60例为CHD组，同期排除冠心病的门诊健康体检者60例为对照组。两组患者采集外周血用密度梯度离心法获取单个核细胞，接种在人纤维连接蛋白包被的培养板，培养贴壁后进行细胞化学分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC_UEA_I和DiI_acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC。进行EPCs水平测定。动脉弹性功能检测仪测定患者的大、小动脉弹性指数(C1、C2）。CHD组患者术后缬沙坦80mg/天干预12、24周后再次检测EPCs水平和动脉弹性指数。结果 CHD组EPCs数量、C1、C2分别为32.8±6.4 EPCs/×200视野、9.82±1.54、3.67±0.87，对照组为61.6±9.5 EPCs/×200视野、15.3±2.52、7.51±2.03，两组差异有显著统计学意义（P＜0.01）；CHD组动脉弹性功能指数与EPCs水平呈正相关（r值分别为0.94、0.98，均P＜0.01）。CHD组患者缬沙坦80mg/天干预12、24周后EPCs数量明显增加（37.7±7.98 vs 50.80±8.10，P＜0.01），动脉弹性指数改善（C1:10.6±1.98 vs 12.55±2.43，C2:4.37±1.03 vs 5.77±1.99，均P＜0.01），差异有显著统计学意义。结论 CHD患者EPCs水平减低和动脉弹性指数下降是冠心病发病的独立危险因素之一，且两者之间呈正相关。CHD患者缬沙坦80mg/天干预12、24周后明显提高EPCs数量和动脉弹性指数。    【关键词】  冠心病；内皮祖细胞；动脉弹性    Association of Endothelial Progenitor Cell and Arterial Compliance in Patients with Coronary Heart Disease and the Effects of Valsartan. CHEN Xu_jiao, WANG Zhi_jun, HE Lang. Department of cardiology, Zhejiang Hospital, Zhejiang, 310013, China   ［Abstract］ Objective To explore the association of the levels of endothelial progenitor cells (EPCs) and arterial compliance in patients with coronary heart disease (CHD) and to observe the variance of the numbers of EPCs and arterial compliance after taking valsartan in CHD patients. Methods Sixty CHD patients demonstrated by coronary angiography and sixty matched control subjects were recruited for this study. Total mononuclear cells (MNCs) were isolated from peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation, and then the cells were plated on fibronectin_coated culture dishes, then attached cells were cytochemically analyzed. EPCs were characterized as adherent cells double positive for DiLDL_uptake and lectin_binding by laser scanning confocal microscope with direct fluorescent staining. Then the number of EPCs was counted. A non_invasive assessment of elasticity index of large artery (C1) and of small artery (C2) using pulse wave was analyzed. The variance of EPCs and C1, C2 in CHD patients taken valsartan 80mg/day for 12 and 24 weeks was measured again. Results 1) The Numbers of EPCs and the level of C1 and C2 were significantly reduced in CHD patients compared with that of aged_matched control subjects(32.8±6.4 EPCs/×200 field、9.82±1.54、3.67±0.87，vs 61.6±9.5 EPCs/×200 field、15.3±2.52、7.51±2.03; P＜0.01). 2) The level of C1 and C2 had positive correlation with the numbers of EPCs in CHD patients (r=0.94、0.98,respectively, P＜0.01). 3) The numbers of EPCs and arterial compliance obviously increased after taking valsartan for 12 and 24 weeks (EPCs/×200 field: 37.7±7.98 vs 50.80±8.10, P＜0.01; C1:10.6±1.98 vs 12.55±2.43,C2:4.37±1.03 vs 5.77±1.99, P＜0.01). Conclusions 1) The levels of EPCs and C1、C2 are indicative indexes for coronary heart disease.2) The level of EPCs is associated with C1、C2 in patients with coronary heart disease.3) valsartan could raise the numbers of EPCs and arterial compliance.   ［Key words］ Endothelial progenitor cells; Arterial compliance; Coronary heart disease; Valsartan    内皮祖细胞（endothelial progenitor cells ，EPCs）是一类能增殖分化为血管内皮细胞的前体细胞。研究表明EPCs不仅参与出生后新生血管的生成，也参与血管内皮损伤后的修复过程［1、2］。动脉弹性功能测定是近年来发展的一种新技术，它是通过对冠心病患者桡动脉脉搏波的检测明确中心大动脉弹性与周围小动脉弹性功能。冠心病是一种多因素作用下的疾病，冠心病（CHD）病人的外周血EPCs数量减少，功能减低，且这种损害与CHD的危险因素呈相关性［3］，冠心病患者小动脉弹性功能也明显降低［4］。本研究旨在通过对冠心病患者外周内皮祖细胞数量及动脉弹性功能测定，揭示冠心病患者中内皮祖细胞数量减少与动脉弹性功能减退之间相关性及缬沙坦干预后内皮祖细胞水平和动脉弹性指数的变化，为冠心病诊治提供依据。1  资料和方法    1.1  一般资料：选择2006年6月至2007年6月在我院心内科住院经冠状动脉造影检查确诊的冠心病患者60例，其中男44例，女16例；年龄60～76岁，平均（64.9±3.9）岁。对照组为同期门诊健康体检者60例，其中男40例，女20例；年龄60～74岁，平均（64.7±3.9）岁。两组患者临床资料基本匹配，无统计学差异见表1。排除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响内皮细胞疾病的患者，近2个月无急性心肌梗死发生；入选患者均未用过他汀类药物；排除明显瓣膜性心脏病，难以控制的高血压或低血压，脑血管意外合并其它严重脏器功能衰竭者。表1  冠心病组和对照组基本资料比较    1.2  方法：入院次日空腹抽血检测血脂(包括胆固醇、甘油三酯)、空腹血糖。所有患者无菌采取外周静脉血20ml，用于内皮祖细胞水平测定，并进行动脉弹性测定。冠心病组患者缬沙坦80mg/天干预12周、24周后再次检测内皮祖细胞数量和动脉弹性指数。    1.2.1  循环内皮祖细胞水平测定：采集入选对象抗凝外周血20ml，Ficoll密度梯度离心法收集白膜层的单个核细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，接种于包被人纤连蛋白(human fi2 bronetin，Sigma公司)的24孔培养板中。在添加了青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml、VEGF 50ng/ml(Pepro Tech公司)、20%优质胎牛血清(Hyclone公司)的M199(Hyclone公司)培养液中培养，3～4d更换培养液1次；培养14d后倒置相差显微镜下计数细胞克隆形成单位。    1.2.2  循环内皮祖细胞鉴定：细胞与DiI2Ac2LDL(Molecular Probe公司，2.4ug/ml)37℃下孵育1h以检测EPCs对acLDL的摄取。然后用2%多聚甲醛固定细胞10min。固定后用PBS液浸洗，再将FITC2U EA2I(Vector公司，10ug/ml)加于上述标本37℃下孵育1h。荧光显微镜(fluorescence microscope, Lei2 ca)鉴定DiI2Ac2LDL和FITC2U EA2I染色双阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞。    1.2.3  动脉弹性测定：所有患者均采用HDI CVProfior Do_2020动脉脉搏波分析仪（美国HDI公司生产）测量大动脉弹性指数（C1）、小动脉弹性指数（C2）。受试者休息10min后，取平卧位，选择合适的气囊同步测量左臂血压，固定右臂，在右前臂横纹上方桡动脉搏动最强处固定探头，调节探头上的旋钮得到满意的脉搏图形取最大的信号强度，记录30秒脉搏波后，仪器自动分析结果，给出C1、C2值。共测量3次，每次测量间隔5min，取3次平均值。    1.3  统计分析：所有资料用SPSS 13.0统计包进行统计分析。计量资料以x－±s表示。组间均数比较方差齐采用t检验，方差不齐采用秩和检验。相关性分析采用双变量相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  两组患者动脉弹性指数和内皮祖细胞水平比较：见表2。表2  两组患者动脉弹性指数与内皮祖细胞水平值比较注：与对照组比较P＜0.01    2.2  冠心病患者动脉弹性指数与内皮祖细胞水平相关性分析：冠心病患者大动脉弹性指数和内皮祖细胞水平的相关系数为0.94，小动脉弹性指数和内皮祖细胞水平的相关系数为0.98，均P＜0.01。    2.3  冠心病患者缬沙坦干预12周、24周动脉弹性指数与内皮祖细胞水平的变化：见表3。表3  冠心病患者缬沙坦干预后动脉弹性指数与内皮祖细胞水平的变化(注：与干预前比较P＜0.05，与干预12周比较△P＜0.053  讨论    冠心病是一种多危险因素疾病，各种心血管危险因素引起内皮细胞损伤和功能障碍在冠状动脉粥样硬化发生发展过程中扮重要角色。1997年Asahara［1～2］等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，将其命名为血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)。EPC不仅参与人胚胎血管生成，也参与出生后的血管新生和内皮损伤后的修复过程。研究表明冠心病患者内皮功能障碍的本质是内皮损伤和损伤之间动态平衡的破坏［3］。内皮损伤后的修复过程除了原先存在的邻近成熟内皮细胞的出芽或迁移外，最近研究表明，也可以通过EPC分化为成熟内皮细胞参与修复损伤的内皮。动物实验和临床研究均证实，新生血管中25％的内皮细胞是由EPC分化而来的［5～6］。血管损伤时，骨髓EPCs释放至外周血，分化、增殖、迁移并整合至内皮缺损部位，参与内皮修复过程［7～8］。有学者［9］认为循环EPCs是修复损伤血管的细胞库。正常情况下内皮损伤和EPCs修补之间存在动态平衡，维持内膜完整性，而EPCs数量减少可能影响内皮修复，导致内膜完整性受损，促使动脉粥样硬化发生发展［10］。Vasa［11］等研究发现，冠心病患者循环血中的EPC数量下降了近40％，迁移能力受损，并与危险因子的数目成反向线性关系。Hill［3］等也报道，EPC数量与冠心病Framingham危险因素积分成反向线性关系。因此EPC可能可作为血管功能和心血管危险因素的一个替代生物学指标，并且由于EPC在缺血组织的血管新生过程中具有重要作用，EPC数量减少和功能受损可能导致冠心病患者冠状动脉自身修复能力降低与缺血心肌新生血管减少。    内皮功能障碍在小动脉（阻力血管与微循环）首先发生功能性改变。动脉内皮功能障碍的早期表现是小动脉弹性减退。动脉弹性又称为内皮依赖性动脉顺应性，动脉弹性指数是脉搏压力波经优化的Windkessek模型分析后得出的指数，包括C1、C2。C1是舒张期血流容积减少与压力下降之间的比值，又称容量顺应性；C2是舒张期血流容积振荡变化与振荡压力之间的比值，又称振荡顺应性。而脉搏压力波图形主要是由心室收缩引起的压力和外周发射波组成。在顺应性好的血管，反射波在舒张期返回，引起舒张压的升高。而在顺应性差的血管，反射波在收缩期返回主动脉，引起收缩压的升高。已有大量研究证实动脉弹性指数，尤其C2是血管病变的敏感指标［12］。Nigam［13］等比较了冠心病和无冠心病患者内皮功能和动脉僵硬度之间的相关性，结果表明动脉僵硬度的增加可能是冠心病患者内皮功能失调的结果。是导致冠心病发病的独立危险因素。    陶军等［4］研究年龄对循环内皮祖细胞及动脉弹性的影响，探讨循环内皮祖细胞水平与动脉弹性损伤的关系。结果发现老年组与青年组相比较,C1和C2明显降低，循环内皮祖细胞数目明显减少，循环内皮祖细胞水平与动脉弹性指数变化呈正相关。因此增龄导致循环内皮祖细胞数量减少，提示血管内皮修复能力下降和功能障碍，动脉弹性指数，循环内皮祖细胞水平有可能作为评价血管功能的替代指标。    《美国高血压杂志》［14］报道，以色列霍伦市Wolfson医学中心的Reuven Zimlichman博士及其同事以22例原发性高血压病人为研究对象，在病人每天服用缬沙坦80mg或160mg治疗3个月前后应用校准的张力计测定大小动脉的顺应性。他们发现，血压水平在治疗期间出现下降，平均收缩压从开始时的172mmHg下降为3个月末时的142mmHg。在同样的时间内，平均舒张压从95mmHg下降为82mmHg，全身血管阻力下降了15%。经过缬沙坦治疗，大动脉顺应性改善22%，而小动脉顺应性增加了35%。在第一个月缬沙坦治疗过程中血压变化明显，而动脉弹性只有在治疗3个月以后才逐渐改善，且具有统计学意义。血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦能够降低高血压相关性动脉僵硬。    Ferdinand等［15］进行一项前瞻性双盲平行组研究，随机给予18例2型糖尿病者olmesartan（40mg）或安慰剂治疗12周。在治疗前、后检查循环CD34+造血的祖细胞（流式细胞计数法）和EPCs（体外测定）。结果发现糖尿病患者的EPCs数目明显少于38例年龄匹配的健康者，应用伊贝沙坦疗法在治疗4周后，EPC数目已经明显增加，从每个高倍视野196±15增至300±23（P＜0.05）。在12周疗法终结时，患者的EPCs为每高倍视野310±23（与基线比P＜0.05）。研究结果表明，血管紧张素II受体拮抗剂可以增加2型糖尿病患者的再生性EPCs数目。    本研究通过检测冠心病患者动脉弹性功能指数以及外周血中内皮祖细胞水平测定以及缬沙坦干预12周、24周后两者的变化。结果表明冠心病患者较对照组大小动脉弹性指数明显下降，尤其是C2指数，而且冠心病患者外周循环中内皮祖细胞水平明显下降，组间差异有统计学意义。动脉弹性指数下降和内皮祖细胞水平下降之间呈正相关，有统计学意义。缬沙坦干预12周、24周后内皮祖细胞水平和动脉弹性功能明显改善，差异有统计学意义。因此我们认为内皮依赖性动脉弹性指数和循环内皮祖细胞水平可以作为冠心病患者发病的独立危险因素之一，两者呈正相关，缬沙坦干预能改善内皮功能。    通过内皮依赖性动脉弹性测定以及循环内皮祖细胞水平测定，可以早期发现冠心病患者亚临床血管内皮功能损害，早期予缬沙坦等药物干预治疗，可改善内皮功能，减少心血管事件的发生。而对于冠心病二级预防来说，通过动脉弹性测定以及内皮祖细胞水平测定，并积极予缬沙坦药物干预，能改善患者预后，减少再次发生心血管事件，提高生活质量以及远期生存率。因此笔者认为，动脉弹性测定和循环内皮祖细胞水平测定能为冠心病一级二级预防提供一种新手段新思路，具有重要临床意义。【参考文献】  ［1］Murayama T, Tepper OM, Silver M, et al. 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