阿托伐他汀与阿司匹林对大鼠脑缺血再灌注后MPO、SOD影响的研究

阿托伐他汀与阿司匹林对大鼠脑缺血再灌注后MPO、SOD影响的研究作者：倪红，储照虎，刘新亚    作者单位：(温州医学院附属台州医院，浙江临海 317000)    【关键词】  阿托伐他汀 阿司匹林 大鼠 脑缺血再灌注 MPO SOD    他汀类药物具有改善内皮功能、抗血小板聚集、稳定斑块、抗炎作用及诱导细胞凋亡等非调脂作用。Endres M[1]等动物试验结果，发现辛伐他汀还能够降低脑梗死的面积。阿司匹林主要通过抑制单核/巨噬细胞系统的COX_2产生兼有抗血小板和抗炎的双重作用。本试验对大鼠实验性CIR后观察不同时间点的脑组织匀浆髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的变化，并在不同时间分别给阿托伐他汀、阿司匹林干预，探讨阿托伐他汀预防作用及其与阿司匹林比较，为脑梗死患者的治疗、预防提供新的思路。1 材料与方法　　1.1 材料：健康雄性SD大鼠110只，鼠龄3～4个月，体重在280～330g，由南京青龙山实验动物养殖中心提供，等级：cl。阿托伐他汀(atorvastatin,立普妥)每片10mg,批号2004CJ22517，由辉瑞制药有限公司生产，肠溶阿司匹林(aspirin)每片10mg,批号060411,由南京白敬宇制药有限公司生产。MPO、SOD试剂盒购自南京建成生物研究所。　　1.2 MCAO模型的制备：大鼠腹腔内注入戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，将其仰卧在手术台上，参照Koizumi J和Zea Longa[2]的方法，制备大鼠MACO模型。MCAO模型制成后，参照Zea Longa[4]标准评分：0分，无神经功能缺损症状者;1分，不能伸展对侧前爪者;2分，行走时向偏瘫侧转圈;3分，向偏瘫侧倾倒;4分，不能自发行走，意识丧失。其中0分及4分者摒除，每个亚组缺少者补足。　　1.3 实验分组及用药方法：按随机化原则将大鼠分为假手术对照组(sham)(n=5)、脑缺血再灌注组(CIR)(n=25)、阿托伐他汀组(atorvastatin,ATO)(n=40)。CIR组按制作模型后断头时程不同又分为6h、12h、24h、48h、72h共5个亚组(n=5)。阿托伐他汀组按给药时间不同又分为给药四周、两周、三天、造模后即时四个亚组，每个亚组分别于12h、24h断头。阿托伐他汀(20mg/(kg·d))，阿司匹林(10mg/(kg·d))用蒸馏水溶解,每天灌胃1次。各组SD大鼠在达到时程要求后，腹腔给以过量3%戊巴比妥钠深度麻醉，迅速断头取脑，在鼠脑前联合水平相当于脑缺血损害的中心区即鼠脑中线左侧旁开8.2mm前囟后方0.8mm处，在冰块上取约5g左右，用于脑组织匀浆法的测定。将脑组织用0.9%的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重后将脑组织置于玻璃匀浆管内，用0.9%的生理盐水作为匀浆介质(是脑组织的9倍)，将其下端插入盛有冰水混合物的器皿中，将捣杆垂直插入管中，上下转动研磨数十次(约为3～5min)，充分磨碎使脑组织匀浆化，研磨后将匀浆离心15min(3000～4000r/min)，取上清液，即为10%脑组织匀浆。-70℃冰箱存储待测。　　MPO、SOD活性检测按试盒进行。计算公式：组织匀浆中总SOD活力(U/mg prot)=(对照管吸光度-测定管系光度)÷对照管吸光度÷50%×反应体系的稀释倍数÷组织中蛋白含量(mg/ml)。MPO酶活力单位计算公式:MPO[U/g(湿片)]=(测定管A值-对照管A值)/11.3×取样量(g)　　1.4 统计学处理：应用SPSS11.0统计软件包进行资料处理，多组均数间的比较采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用q检验，双变量关系采用直线相关分析，显著性水准均为α=0.05。2 结果　　2.1 脑组织匀浆MPO及SOD含量的变化：各CIR组不同时段脑组织匀浆MPO含量均明显高于sham组，见表1，缺血6h已明显增高，24h达高峰，24h以后逐渐减低，至3d接近sham组水平，见表1。CIR各亚组之间有显著差异(P<0.01)。脑组织匀浆SOD含量的变化规律，CIR组不同时段脑组织匀浆SOD含量也明显低于sham组(P<0.01)，见表1，缺血6h亚组已明显减少，随时间延长进一步降低，72h下降最为明显(P<0.01)，见表1。CIR各亚组之间均有显著差异(P<0.01)。表1 CIR组不同时段脑组织匀浆MPO、SOD含量的变化注：与Sham组比较#P<0.05，CIR组各组间均有显著性差异P<0.01　　2.2 干预后MPO及SOD含量的变化：以阿托伐他汀干预后，脑组织匀浆MPO含量明显减少(P<0.01)。阿托伐他汀干预组内亚组间两两比较均有显著差异(P<0.01)。与CIR组相应亚组之间两两比较以四周、两周亚组最为显著(P<0.01)，三天组有显著性差异，即时组与CIR组之间两两比较无显著差异(P>0.05)。阿司匹林干预各亚组与CIR组间两两比较，四周组、两周亚组均有显著性差异(P<0.01)，而三天、即时组无显著性差异(P>0.05)。阿托伐他汀与阿司匹林干预组间除即时亚组无显著性差异外，其他均有显著性差异(P<0.05)，见表2。　　阿托伐他汀、阿司匹林干预后，脑组织匀浆SOD含量均有增加，阿托伐他汀不同时段与CIR组相应各组之间两两比较除即时组外均有显著差异(P<0.05)见表2，阿托伐他汀干预组内又以四周组增加最为显著，四周、两周亚组与三天、即时亚组之间两两比较亦有显著差异(P<0.01)。阿司匹林两周、三天、即时组与CIR相应组之间无显著差异(P>0.05)。阿托伐他汀与阿司匹林组间比较四周组、两周亚组间有显著差异(P<0.05)，三天亚组、即时亚组间无显著差异(P>0.05)。表2 脑组织匀浆CIR组与ATO及APC干预组MPO、SOD含量的变注：CIR组与ATO、APC组之间比较⊿P<0.05，P<0.013 讨论　　脑组织的缺血再灌注损伤产生大量氧自由基，这些氧自由基主要包括O-2、羟自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)等可直接损害血管内皮细胞和平滑肌细胞、诱导内皮细胞凋亡，灭活NO、降低NO生物利用度，刺激内皮细胞释放血管细胞黏附因子(ICAM_1)和单核细胞趋化蛋白_1(MCP1)等[3]。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内的主要抗氧化酶之一,可有效清除氧自由基。SOD对人体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,能清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤。氧自由基的大量产生,可导致脑组织中抗氧化反应的物质如SOD的过量消耗。SOD活性降低,提示存在自由基损伤[4]。有研究[5]显示阿托伐他汀直接激活内皮型一氧化氮合酶,使一氧化氮合酶mRNA表达上调增加NO合成，并增加SOD活性,从而降低血管局部ROS含量,提高NO的水平,减轻内皮受损。脑缺血再灌注后较持续性缺血中性粒细胞浸润发生早,程度重，MPO是位于中性粒细胞中嗜苯胺蓝体内的血红素蛋白，MPO活性反映中性粒细胞脑组织中的积聚程度。　　本实验中，我们应用组织匀浆法测量鼠脑缺血周围组织和坏死组织中SOD含量和MPO活性，表明缺血周围组织SOD逐渐下降，提示脑缺血再灌注损伤后有大量氧自由基产生，导致脑组织中抗氧化反应物质SOD的过量消耗，证实自由基损伤在大鼠脑组织缺血再灌注损伤中发挥重要作用。Sham组每克湿重几乎测不到MPO活性，CIR组MPO活性增高，提示了脑缺血再灌注后有中性粒细胞浸润，中性粒细胞与再灌注后继发的神经损伤有关。使用阿托伐他汀、阿司匹林干预处理后，表明阿托伐他汀有清除脑缺血再灌注产生的氧化产物如H2O2、NO2-等和有抑制中性粒细胞浸润等作用，具有脑保护作用。这种作用明显优于阿司匹林，且给药时间越长效果逐渐增加。但由于本实验最长只给药四周，再长给药时间有无累加作用尚待进一步研究。【参考文献】　　[1]Endres M, Laufs U, Huang Z, et al. Stroke protection by 3_hydroxy_3_methylglutaryl (HMG)_CoA reductase inhibitors mediated by endothelial nitric oxide synthase[J]. Proc Natl Acad SciUSA, 1998,95(1):8880-8885.　　[2]邢成名,张敏,刘学升.缺血性脑血管病[M].第1版.北京：人民卫生出版社，2003,199.　　[3]Hamilton C A, Brosnan M J. Superoxide excess in hypertension and aging:a common cause of endothelial dysfunction[J]. Hypertension, 2001,37(2):529-534.　　[4]刘煜敏,徐仁佃,黄怀钧,等.兴奋性氨基酸,氧自由基与缺血再灌注脑损伤关系的实验观察[J].卒中与神经疾病,2000,7(2):98-100.　　[5]Masumoto A, Hirooka Y, Hironaga K, et al. Effect of pravastatin on endothelial function in patients with coronaryartery disease ( cholesterol2independent effect of pravastatin)[J]. Am J Cardiol,2001,88(11):12912-12913.