环磷酰胺抗血管生成化疗抑制鼠S180皮下肉瘤血管形成的作用

作者：顾汝军, 王岭 姚青, 张聚良, 陈江浩, 凌瑞, 张海, 王映梅    作者单位：第四军医大学：1西京医院血管内分泌外科，2实验动物中心，3西京医院病理科，陕西 西安 710033

【摘要】  　　目的：研究环磷酰胺（CTX）抗血管生成化疗(ACT)对昆明鼠S180皮下肉瘤血管形成的抑制作用及机理. 方法：将荷S180肉瘤（100 mm3）鼠随机分成A组(CTX抗血管生成化疗组），B组(CTX标准化疗组）和C组(生理盐水对照组）. 按实验方案处理后，检测抑瘤率和肿瘤组织微血管密度，透射电镜观察内皮细胞形态；将接种S180细胞的小鼠随机分成A′组(CTX抗血管生成化疗组），B′组(CTX标准化疗组）和C′组(生理盐水对照组）按实验方案给药，计算成瘤率及肿瘤内的微血管密度. 结果：A，B组抑瘤率分别为89.3%和89.9%，A，B，C组微血管密度计数分别为(7.6±5.2)，(16.5±5.5)和(17.9±4.7)个/mm2，A′，B′，C′组成瘤率分别为43.8%，6.3%和87.5%. 结论：CTX抗血管生成化疗抑制鼠皮下肉瘤微血管形成，并抑制肿瘤的形成和生长.

【关键词】  抗血管生成;化疗；肿瘤；内皮细胞；微血管密度；透射电镜

　　Effect of cyclophosphamide antiangiogenesis chemotherapy on murine subcutaneous sarcoma S180

    GU RuJun1, WANG Ling1, YAO Qing1, ZHANG JuLiang1, CHEN JiangHao1, LING Rui1, ZHANG Hai2, WANG YingMei3

    1Department of Vascular and Endocrine Surgery, Xijing Hospital, 2Laboratory Animal Research Center, 3Department of Pathology,  Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

    【Abstract】 AIM: To observe the effect of cyclophosphamide (CTX) antiangiogenesis chemotherapy (ACT) on the forming of microvessel in murine subcutaneous sarcoma caused by S180 cells. METHODS: Animals with the sarcoma S180 were randomly devided into 3 groups: A, ACT group; B, standard CTX chemotherapy group; C, saline control group. After administration, the microvessel densities of the sarcoma was measured by immunohistochemical method, and the morphological changes of vascellum endothelial cell after different chemotherapy treatments were observed by the transmission electron microscope. And animals implanted with S180 sarcoma cells were also randomly divided into 3 groups: A′, ACT group; B′, standard CTX chemotherapy group; C′, saline control group. After administration, the ratio of tumor formation and the microvessel densities of the sarcoma were calculated. RESULTS: The mean tumor inhibition rates were 89.3% and 89.9% in group A and B, respectively. Immunohistochemical results showed that the microvessel densities in group A, B and C were 7.6±5.2, 16.5±5.5 and 17.9±4.7/mm2, respectively. And the mean tumor formation rates in group A′, B′ and C′ were 43.8%, 6.3% and 87.5%, respectively. CONCLUSION: CTX antiangiogenesis chemotherapy can inhibit the formation and growth of the murine subcutaneous sarcoma by inhibiting the microvessel formation.

    【Keywords】 antiangiogenesis; chemotherapy； tumor； endothelial cell； microvessel density； transmission electron microscope

　　0引言

    恶性实体肿瘤的生长是血管依赖性的. 内皮细胞在肿瘤组织的新生血管的发生，形成和成熟过程中起决定性作用. 以内皮细胞为靶点的治疗可以抑制恶性肿瘤的血管生成，从而抑制肿瘤的生长，浸润和转移. 多种传统的细胞毒性化疗药物如CTX等对内皮细胞有损伤作用，但采用标准化疗方案化疗，在治疗过程中不表现其抗肿瘤血管生成作用. 通过改变给药方案，采用小剂量高频或持续给药法可以持续抑制肿瘤内的新生血管的内皮细胞［1］，抑制恶性肿瘤的发生和发展.

    1材料和方法

    1.1材料雌性4~6 wk龄昆明鼠，体质量（25±3）g，购自第四军医大学实验动物中心，5只1笼，自由进食水. 环磷酰胺粉剂购自山西普德药业有限公司.兔抗鼠CD31抗体购自美国Biolegend公司，SABC试剂盒及DAB购自武汉博士德生物制品公司. 腹水型S180细胞株由第四军医大学实验动物中心张海博士惠赠.  冷冻保存的腹水型S180细胞体外复苏，2000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水稀释，调整瘤细胞至2×109/L，取5只健康昆明种小鼠，每只用上述细胞悬液0.4 mL，ip，7～10 d后接种小鼠腹部明显增大、凸出. 将其麻醉处死，无菌抽取乳白色腹水液，以生理盐水1：1稀释，经台盼蓝染色后计算活细胞数﹥95%，调整瘤细胞密度为2×109/L，120只小鼠右后肢腹股沟部皮下接种0.2 mL，首先取48只分组给药，其余的留待4～5 d形成直径约6 mm，体积(100±20) mm3大小皮下肿瘤的小鼠作为荷瘤鼠，共得到48只，分组给药.

    1.2方法将荷瘤鼠按质量随机分成3组，每组16只，A组（CTX抗血管生成化疗组）：给予环磷酰胺粉剂37.5 mg/kg，加生理盐水调至0.5 mL，灌喂针灌胃给药，每周2次，连用3 wk，总量225 mg/kg；B组（CTX标准化疗组）：第1次给予环磷酰胺450 mg/kg，生理盐水调至0.5 mL，其后每周2次生理盐水0.5 mL灌胃；共3 wk；C组（生理盐水对照组)：给予生理盐水0.5 mL，每周2次，连用3 wk.  将接种S180细胞后的小鼠随机分成3组，每组16只，A′组（CTX抗血管生成化疗组）；B′组（CTX标准化疗组）；C′组（生理盐水对照组），给药剂量及频次同上. 每周d1相同时间内称量小鼠质量，以质量增减来表示毒性反应大小. 游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积及抑瘤率，肿瘤体积=0.52×长径×短径2，抑瘤率(%)=（对照组平均瘤体积-治疗组平均瘤体积）/对照组平均瘤体积×100%. d4及d14计算A′，B′，C′3组成瘤率，以触及皮下直径1～2 mm结节为成瘤标准，成瘤率%=成瘤鼠总数/接种瘤细胞鼠总数×100%，成瘤后测量肿瘤体积.

    1.2.1肿瘤组织内皮细胞及肿瘤细胞形态实验d4及d21随机取A，B，C3组小鼠各2只，乙醚麻醉，无菌条件下切取生长旺盛的肿瘤边缘组织1 mm×1 mm×2 mm大小，制备电镜标本，半薄切片HE染色，光学显微镜观察定位后超薄切片染色后JEM2000X型透射电镜（第四军医大学电镜中心）观察内皮细胞及肿瘤细胞的形态和内部结构.

    1.2.2微血管密度检查实验d21麻醉处死小鼠，切取肿瘤组织，40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片，片厚3~5 μm，分别行HE染色及免疫组化检查. 免疫组化检查采用SABC法，按试剂盒操作说明进行操作. 一抗为兔抗鼠CD31抗体，用PBS代替一抗作为阴性对照，瘤旁正常组织作为阳性对照. 计数方法：选择肿瘤组织细胞间质内孤立的棕黄色的血管内皮细胞或细胞簇或血管腔内径小于8个红细胞者代表一条单独的微血管. 先在低倍视野下找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域，然后在200倍视野（0.7386 mm2）下计数5个视野的微血管数目，取平均值，计算微血管密度.

    统计学处理：采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理，多样本均数比较用方差分析及LSDt检验，样本率的比较用χ2检验，检验水准α=0.05.

    2结果

    2.1抑瘤效果及毒性反应A，B及C组平均肿瘤体积分别为(169.1±57.9)，(159.2±46.3)和(1578.4±123.0) mm3，A，B与C组间P<0.001，平均体质量增加分别为(6.6±2.1)，（-1.1±2.0）和（7.9±4.2）g， A，C与B组间P<0.01，A和B组抑瘤率分别为89.3%和89.9%（P>0.05）. A′，B′和C′3组d4时形成皮下实体瘤的小鼠分别为5，0和11只，成瘤率分别为31.3%，0%和68.8%，组间两两比较P<0.001. d21时形成皮下肉瘤的小鼠分别为7，1和14只，成瘤率分别为43.8%，6.3%和87.5%（P<0.001）. d21时A′，B′和C′3组平均瘤体积分别为(17±7.4)，(15.13±0)和(1121±220) mm3，A′和C′组间P<0.001，平均质量增加为(6.2±1.7), (-0.9±2.3)和（7.2±3.2）g，A′，C′与B′组间P<0.01. CTX抗血管生成化疗和标准化疗都可以抑制肿瘤生长，标准化疗对皮下接种S180肉瘤细胞的昆明鼠抑制成瘤的作用最大，但其毒副反应也最大，在用药的1 wk内有明显的质量下降，其后质量缓慢增加，直至d21增加到用药前体质量，最大的质量丧失超过10%，有2只死亡.

    2.2肿瘤组织内皮细胞形态学改变抗血管生成化疗后d4内皮细胞水肿变性，管腔结构尚完整，没有明显的坏死，d21时内皮细胞少见，无完整的管腔结构形成，内皮细胞及肿瘤细胞大部分坏死，肿瘤细胞核浓缩，较多见凋亡细胞（图1A,B）. 标准化疗d4时即可见内皮细胞坏死，无完整细胞结构，不形成管腔，肿瘤细胞大量坏死，d21时可见大量新生的内皮细胞，结构完整，有完整的管腔（图1C,D）. 生理盐水对照组d4及d21时组肿瘤组织内内皮细胞结构完整，可见完整的管腔，内多含有红细胞及瘤栓等物，微血管成簇样分布，肿瘤细胞核分裂像多见，形态不规则（图1E,F）.

    2.3微血管密度d21时肿瘤组织微血管密度计数A组(7.6±5.2)个/mm2与B组(16.5±5.5)个/mm2，C组(17.9±4.7)个/mm2两两比较P<0.01；B组与C组间比较P>0.05；A′组(3.6±2.5)个/mm2与C′组(15.9±4.6)个/mm2间比较P<0.01, A组与A′组比较P<0.05. A组的１只证实为肌间肉瘤，B组死亡的2只，B′组只有1只，均不参加统计学分析. CTX抗血管生成化疗与标准化疗相比明显抑制微血管生成，这种抑制作用在肿瘤形成过程的早期更强.

    3讨论

    恶性肿瘤的生长、浸润和转移是血管依赖性的. 当肿瘤细胞在体内定植生长至直径1~2 mm的细胞团块时，如果没有新生血管和形成，肿瘤细胞将停止分裂生长，进入生长停滞期. 在肿瘤的新生血管形成过程中，内皮细胞起决定性的作用，这些内皮细胞一部分直接来自肿瘤组织内原有血管的内皮细胞的芽生生长，一部分来自于骨髓内的内皮祖细胞的动员和释放［2］. 针对肿瘤内皮细胞的抗血管生成治疗，成为临床上为克服传统标准化疗的肿瘤细胞耐药，化疗相关毒性如骨髓抑制，粘膜炎等的一个新方法［3］. 传统的细胞毒性药物，在杀伤肿瘤细胞的同时，也损伤肿瘤组织内的内皮细胞功能，但传统的标准化疗是基于最大耐受剂量(maximum tolerated dose）这一原则的，为减轻化疗相关的毒副反应，在两个化疗周期之间需要一个较长的间隙期（2～3 wk），在这个间隙期内，损伤的内皮细胞可以得到恢复，从而抑制了标准化疗的抗血管生成的效应［1］. 我们用透射电镜直接观察荷瘤鼠在标准化疗后d4和d21时的内皮细胞的超微结构，从形态学上证明了这一点. 标准化疗虽然抑制肿瘤的生长，但并不抑制肿瘤内的微血管的形成，其抑制肿瘤的作用是通过大量杀伤肿瘤细胞来现的.

    通过降低给药浓度和增加给药频率的方法，可以抑制内皮细胞在化疗过程中的损伤修复过程，这种化疗方法称之为抗血管生成化疗. 所谓的抗血管生成化疗也就是采用低于最大耐受剂量的小剂量化疗药物，高频或者持续给药，连续应用，没有长时间的间隙期. 在体外试验中证明内皮细胞对传统的细胞毒性化疗药物比肿瘤细胞及机体其它正常细胞更敏感. 敏感性相差10～100倍［4］. 这为细胞毒性化疗药物针对内皮细胞细胞的治疗提供了一个治疗窗口. 但抗血管生成化疗并不能完全抑制小鼠成瘤，说明单纯的抗血管生成化疗并不能完全抑制肿瘤细胞早期的定植生长. 在肿瘤的治疗过程中抗血管生成化疗应和其他治疗方法联合应用［5-6］.

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