蛋白质组学技术在心血管疾病研究中的应用

作者：张伟英，赵猛，兰小鹏    作者单位：1.福建医科大学教学医院南平市第一医院，福建 南平 353000;2.南京军区福州总医院

【摘要】  蛋白质组学是现代科技的前沿，蛋白质芯片是20世纪末出现的最新一代生物芯片，因其高通量、高敏感、高效快捷等优点被广泛应用于生命科学领域，并取得一系列突破性进展。本文概述了蛋白质组学在心血管疾病的致病机制和临床治疗等相关领域的研究进展。

【关键词】  蛋白质组;蛋白质组学;心血管疾病

随着生命科学研究的不断深入，人类基因组工作草图的公布标志着基因框架已经绘就。数万个基因负载着大量生命信息，但这些核苷酸系列并不能完全决定基因的功能。蛋白质是基因指导合成的最终产物，直接反映基因给予的信息，几乎所有的生化反应都发生在复杂的蛋白质分子之间。基因组、后基因组及蛋白质组学的研究引起人们的极大关注，尤其是高通量分析蛋白质组的变化是生命科学的一项里程碑式的发展[1]。心血管疾病是人类的多发病、常见病之一，逐渐成为危害人类生命健康的主要病因。心血管疾病的发生和发展涉及动态、复杂及精细的细胞内过程。蛋白质作为细胞的基本功能单位，广泛参与细胞的功能与调节，并决定细胞、组织和器官的表型。蛋白质组学已被应用于医学和药学的各个领域，它直接从蛋白质着手来探讨疾病发生过程中蛋白质种类及数量的变化，在阐明疾病的分子生物学机制、发现新的疾病标志分子、研究治疗药物新靶点和药物毒理学等方面都有广泛的应用[2]。目前，临床上蛋白质组学已广泛应用于扩张型心肌病、心肌缺血、心肌肥大、心力衰竭和冠心病等心血管疾病的研究。

　　1 扩张型心肌病的蛋白质组学研究

　　扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一类病因不明的心肌疾病，其主要特征是心室扩张，室壁变薄，心肌收缩期泵功能障碍，产生充血性心力衰竭。在细胞水平可见心肌细胞肥大变性，间质纤维化等改变。迄今为止，DCM是利用蛋白质组学研究最为深入的一类心血管疾病。

　　Jungblut等[3]采用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分析DCM患者活检标本及因出现心力衰竭而进行心脏移植的正常供体心肌组织相关蛋白，在3300种心肌蛋白中鉴定出150种，证实其中25种在DCM时发生显著变化，已鉴定出ATP合酶β链、ATP合酶、肌原纤维和线粒体的肌酸激酶、3-oxoacyl-CoA硫解酶、异柠檬酸脱氢酶、结合珠蛋白片段、血红蛋白а链、血红蛋白β链等12种蛋白质。以热休克蛋白(Hsp)27的多克隆抗体亲和纯化得到59种蛋白，其中9种经MALDI质谱肽质量指纹图和测序分析证明属于Hsp27蛋白。Weekes等[4]对牛先天性DCM心肌进行2-DE分析，证实其存在线粒体相关蛋白表达的改变，共35个相关蛋白质点，24种蛋白质表达下降，11种蛋白质丰度增高，降低的蛋白质包括线粒体和能量代谢表达的蛋白，包括：肌酸激酶M、细胞色素C氧化酶、细胞色素b5、肌红蛋白、3，2-transenoyl-CoA转移酶。Fountoulakis等[5]研究间线蛋白缺乏导致小鼠DCM心脏线粒体蛋白质组变化时证实其蛋白质组的变化与已知间线蛋白缺乏时表型的变化相对应。

　　2 心肌缺血、再灌注、损伤的蛋白质组学研究

　　心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/R)包括从轻微缺血时的可逆性损伤到严重缺血时不可逆性细胞坏死。研究该过程中蛋白质组的变化，是理解这一病理过程的基础。

　　De Celle等[6]研究了大鼠持续心肌缺血(permanent ischaemia，PI)和缺血-再灌注(IR)2种模型中蛋白质组的改变。PI组结扎冠状动脉左前降支120 min，IR组缺血维持30 min，再灌注180 min。通过对左心室缺血的组织用2-DE进行分离，比较心肌细胞液和膜碎片的蛋白质密度变化，发现PI组和IR组共有32种不同的蛋白质点表达，PI组有20个蛋白质点表达水平改变，IR组有4个蛋白质点表达水平改变，共同改变的蛋白质点有8个;运用MALDI-飞行时间质量光谱测定(TOF-MS)鉴定后分为结构蛋白、热休克蛋白、代谢和炎症相关等蛋白。Yan等[7]研究猪的冠状动脉狭窄缺血模型和不缺血的冠状动脉区域做对照，发现在缺血区域的心肌壁增厚。使用无偏差蛋白质组联合2-DE方法，肽定位图使用MS法，蛋白质鉴定使用序列数据库，证实了组织蛋白酶-D表达增加，它是一种引起细胞自我吞噬的蛋白质。此外，还有组织蛋白酶-B，热休克同类蛋白(HSP73)表达。White等[8]等发现缺血-再灌注后兔离体心脏中肌小节和细胞骨架蛋白、氧化还原调节蛋白、能量代谢蛋白、应激反应蛋白等53个蛋白表达改变。研究者认为损伤引起的心肌顿抑可能是蛋白质组的一些轻微、迅速的瞬时变化所致。近年来，对心肌缺血保护机制的研究主要集中于对蛋白激酶C(PKC)功能蛋白质组学的探讨。

　　3 心肌肥大的蛋白质组学研究

　　心肌肥大是对高血压、心肌梗塞、扩张型心肌病等因素造成心脏长期负荷过度的一种慢性代偿反应，心肌细胞体积增大、重量增加，心肌总收缩力增大、心输出量提高。Logan等[9]首先在苯福林处理的大鼠心肌蛋白研究中证实了随着心肌肥厚改变的11个蛋白质点，其中肌球蛋白轻链(MLC)1和MLC2显著增加，而HSP 60和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-泛醌氧化还原酶(线粒体内膜蛋白)的表达下降。Arnott等[10]观察了肾上腺素诱导的初生心肌肥大(cardiohypertrophy)的乳鼠心室肌细胞蛋白电泳图谱，发现有11种蛋白与心肌肥大相关，其中8种表达增加，3种表达减少，如MLC2a含量平均增高106%(n=9，P<0.01)。通过Northern杂交和免疫荧光染色发现MLC2表达增加与心肌肥大相关。最近Joseph Macri实验室进行了初生的心肌肥大大鼠的蛋白质分析，发现内皮素(ET)诱导产生的心肌肥大导致21种蛋白质成倍减少，而且ET诱导的心肌肥大还伴有MLC1和MLC2减少，达30%[11]。

　　4 心力衰竭的蛋白质组学研究

　　心力衰竭可由多种病理因素引起，在病理情况下蛋白质的变化也是多种多样的。心力衰竭的临床表现有左心室泵血功能降低、射血分数下降、心脏扩大、神经体液反应活化，在细胞水平出现心肌细胞形态和收缩功能的变化。心力衰竭直接相关的分子和细胞改变与临床上心功能受损、疗效、衰竭进程和患者预后的关系并没有确定，不同病因引起的心力衰竭疾病过程，临床表现，预后也有差异，这些差异必然是由其不同的蛋白质特征决定的。蛋白质是生理、病理过程的直接执行者，不同的疾病过程，不同的治疗反应，不同的预后必然由蛋白质含量、结构、蛋白质翻译、修饰及蛋白质间相互关系的改变所导致。直接对心力衰竭过程中蛋白组学的研究是揭示细胞生命本质特征的重要方案，有助于了解心衰时心肌细胞功能障碍及代偿作用的分子机制。

　　Heinke等[12]以右室起搏(245次/min，3～4周)诱发犬心力衰竭，取左心室肌组织进行二向电泳和MALDI-MS质谱分析，发现在pH 3～10的范围内分离的蛋白质分子量为10～150 kDa，有31种蛋白质发生明显变化，其中21种数量减少，10种增加。Jiangt[13]等采用电起搏诱发犬心衰(240次/min持续4周，210次/min持续8周)，对其心肌组织进行蛋白质组研究：共分离出700个蛋白质点，其中62个点明显变化，从中鉴定出23种蛋白，对其中6种进行基因芯片分析。通过对所得蛋白的分类比较，认为以下三类亚细胞器蛋白的变化：线粒体蛋白下调、糖酵解酶上调、细胞骨架蛋白改变，与心衰相关。新近研究中，Casey等[14]比较了内皮素-l(ET-1)诱导的向心性肥大与白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF)诱导的离心性肥大心脏的蛋白质组变化。2-DE图谱显示 ET-1组和LIF组分别有15个、17个蛋白质点表达改变，有9种蛋白变化仅出现在ET-l组，11种蛋白变化仅出现在LIF组，提示不同的刺激物可通过不同的信号途径引起相应的不同形态学改变。

　　5 冠心病的蛋白质组学研究

　　冠心病作为全球发病率和死亡率都占前列的疾病，其发病机制尚未完全阐明。蛋白质组学技术的出现，为我们能更清楚地认识并治疗该疾病提供了一个新的方法。You等[15]运用定量实时聚合酶链式反应(PCR)分析显示病变冠状动脉铁蛋白轻链mRNA表达减少，而Western印迹分析表明铁蛋白轻链表达显著增加，提示这可能与蛋白质稳定性表达增加或病变组织中蛋白转录后水平上调有关。Koenig等[16]研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂C对冠心病预后的影响时发现它与二次心血管疾病事件的危险率有明显正相关性，并可能成为冠心病诊断的一个有效指标。Donahue等[17]研究53例冠状动脉血管造影确认的冠心病患者和53名健康对照者，按其年龄和种族以及其他危险因素进行比较，除外主要的血浆蛋白异常，鉴定低丰度蛋白质。结果95种与正常对照不同，证实了在血管造影有冠脉疾病和无冠脉造影疾病的群体大量蛋白质丰度不同。

　　由上可见，当前许多心脏疾病的细胞和分子机制研究相对比较匮乏，以基因表达产物蛋白质为主要研究对象、旨在最终揭示疾病转化规律的蛋白质组学技术在该领域的应用前景必将十分广阔，并将为心功能障碍相关疾病的诊断和治疗提供有益的理论基础。但是一个不容忽视的问题是：现有心脏疾病的蛋白质组数据库仍然比较有限，且多集中在对一些动物种系的研究，因此人类心血管疾病的蛋白质组学研究工作任重道远。我们相信随着技术的发展，蛋白质组学必将为生物和医学的发展带来一次革命。不久的将来，现行的结构蛋白质组学必然向功能蛋白质组学过渡，为心血管疾病的早期诊断、新药研发以及心脏康复开辟新的思路。

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