过氧化酶体增殖物激活受体α抑制血管紧张素Ⅱ促心肌纤维化作用的试验研究

作者:侯晓阳

作者单位：教育部和卫生部心血管重构和功能研究重点实验室

 【关键词】  过氧化酶体激增剂 转录因子 心肌纤维化

      APeroxisome proliferatorsactivated receptor α

    play a critical role in the inhibition of myocardial

    fibrosis induced by AngⅡ in vitro

    HOU Xiaoyang, BU Peili, ZHANG Yun, FENG Jinbo, LIU Chunxi, LI Chuanbao, HAO Mingxiu

    （Key Laboratory of Cardiovascular Remondeling and Function Research， Chinese Ministry of

    Education and Chinese Ministry of Public Health； Denpatment of Cardiology， Qilu Hospital，

    Shandong University， Jinan 250012， Shandong， China）

    ［ABSTRACT］  Objective： To explore the effect of peroxisome proliferatorsactivated receptor α on myocardial fibrosis induced by angiotensinⅡin vitro. Methods： Cardial fibroblasts (CFs) of neonatal Wistar rats were isolated and cultured, and  were stimulated with AngⅡ. CFs proliferation was measured by thiazolyl blue（MTT）assay. mRNA was measured by reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RTPCR).  Results： Compared with the control group, after a 12hour treatment with AngⅡ, mRNA expression of collagen I and TIMP1 in CFs was increased, but  MMP2 was significantly decreased while the  MTT value of CFs was increased. Bezafibrate, a kind of PPARα activators， inhibited the above changes in a dosedependent manner except for the MTT value, of which no significant changes were produced. MK886, a kind of PPARα antagon, abrogated the action of Bezafibrate.  Conclusion：  The results suggest that the PPAR αdependent pathway is critically involved in the inhibition of myocardial fibrosis in vitro.

    ［KEY WORDS］  Peroxisome proliferators； Transcription factors； Myocardial fibrosis

　　心肌肥厚是高血压病常见的靶器官损害，主要表现为心肌细胞肥大、心脏成纤维细胞(cardial fibroblasts, CFs)增殖及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积。在心脏ECM中，胶原占85％，其中主要是Ⅰ型胶原，因此，抑制CFs的增殖及胶原的合成并促进其降解是预防和逆转ECM重构的关键环节。CFs占心脏组织细胞总数的2/3，是心脏胶原合成最主要的细胞；胶原的降解则主要是由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）和金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）的相互作用来调节的。过氧化酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatorsactivated receptor, PPAR）α是核受体超家族成员，与心血管疾病密切相关［1］。我们在体外条件下，以血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）刺激体外模拟CFs纤维化［2］，来探讨PPARα激动剂苯扎贝特（bezafibrate）对胶原代谢的影响，为心肌纤维化的防治探索新的思路。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验用品  新生Wistar大鼠由山东大学医学院试验动物中心提供；低糖DMEM培养基系GIBCO公司产；新生小牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶、MTT、MK886、苯扎贝特和 ［Val5］Angiotensin Ⅱ均购自Sigma公司；异硫氰酸胍、Taq DNA聚合酶、逆转录酶（MMLV）、dNTP均购自Fermentas公司；引物由上海博雅生物公司合成；小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体、小鼠抗大鼠肌动蛋白单克隆抗体、羊抗小鼠IgGFITC二抗均由武汉博士德生物公司生产。

1.1.2  实验仪器  Olympus DPTO荧光倒置显微镜系日本Olympus公司生产;PCR扩增仪由德国Biometra公司提供；凝胶照相系统系美国Alpha innotech公司生产;InTec Reader 2010型酶联免疫检测仪由上海生物器械公司提供。

    1.2  方法

    1.2.1  CFs培养与细胞鉴定  无菌条件下开胸取出新生Wistar大鼠心室部分，PBS漂洗后，剪成约1?mm3碎块，0.25%胰蛋白酶37?℃消化20?min，用含20%小牛血清的等量DMEM终止消化，1?000?r/min离心8?min， PBS洗涤1次，将所得细胞置于10%小牛血清DMEM培养液中，37?℃、5%CO2培养箱内贴壁60 90?min，差速贴壁去除心肌细胞。细胞生长至近融合状态时按1:3传代，试验采用第3 4代细胞，CFs生长至融合的70%时，换含1%小牛血清的DMEM培养液，37?℃继续孵育24?h，使细胞进入生长静止期，随机分为5组：①空白对照组；②苯扎贝特（10-5mol/L）组；③AngⅡ（10-7mol/L）组；④苯扎贝特（10-7 10-5mol/L）＋AngⅡ组；⑤MK886（10-7mol/L）＋苯扎贝特＋AngⅡ组。各组干预平行进行，MK886预先干预30?min后加不同浓度的苯扎贝特干预30?min，再加AngⅡ作用12?h，不加药物时加溶解药物的溶剂。

    原代细胞培养至接近融合，胰酶消化，接种到铺有载玻片的培养皿中，继续培养至细胞接近融合状态，吸去培养液，PBS洗3次，每次1?min；4％的甲醛固定15?min，PBS洗3次，每次2?min；0.5％ TritonX100孵育5?min，共2次；3％H2O2处理标本15?min，后于含5％羊血清的PBS中封闭20?min，分别加不同的一抗4?℃过夜，PBS洗3次，每次5?min；加荧光标记的二抗孵育30?min，PBS洗3次，每次5?min，然后在荧光倒置显微镜下观察并照相。

    1.2.2  MTT比色法检测心脏成纤维细胞增殖  将对数生长期CFs接种于96孔板中， 细胞5×103个/孔，37?℃、 5%CO2饱和湿度下培养，24?h后换含1%血清的DMEM培养液，继续培养24?h，使细胞进入生长静止期，弃上清液，分别加入含各种干预药物的全培养基180?μl继续培养48?h,每组设5个复孔，各组于药物刺激结束前4?h，加MTT(5?g/L)20?μl/孔，继续培养4?h后终止,吸弃孔内培养液，每孔加入二甲亚砜150?μl，振荡10?min使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上490?nm波长处测定光吸收值(A490值)，用只加二甲亚砜没有细胞的空白孔调零。

    1.2.3  RTPCR检测基因mRNA的表达  测定CFs Collagen I、MMP2、TIMP1 mRNA的表达。采用异硫氰酸胍-氯仿一步法提取细胞总RNA，适量DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度计测定260?nm和280?nm处吸光度值A(A260,A280)以估计mRNA的浓度和纯度。以1?μg总RNA反转录生成20?μl产物，反转录体系在37?℃反应60?min,95?℃反应5?min,4?℃冷浴,完成cDNA的合成。配PCR反应体系扩增目的基因及内参照GAPDH。所用引物，见表1。PCR反应条件：95?℃预变性5?min；95?℃变性45?s，退火45?s，72?℃延伸60?s，进行30个循环；72?℃延伸7?min。将PCR产物10?μl加2?μl溴酚蓝，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下凝胶成像分析系统记录结果，待测基因mRNA相对表达量以其扩增带光密度值与相应内参照扩增带光密度值的比值表示。

    1.3  统计学处理  数据以表1  PCR特异性引物及扩增条件

    引物序列（5′3′）PCR 扩增片段大小（bp）退火温度（T/℃）ACAGCACGCTTGTGGATse46950GTCTTCAAGCAAGAGGACCAas  MMP2GTGCTGAAGGACACCCTCAAGAAGAse60556TTGCCGTCCTTCTCAAAGTTGTACGasTIMP1GCCATGGAGAGCCTCTGTGGse31056GCAGGCAGGCAAAGTGATCGasGAPDHTCCCTCAAGATTGTCAGCAAse30852AGATCCACAACGGATACATTas

2  结  果

    2.1  细胞鉴定  倒置显微镜下观察，细胞呈梭形,胞体较大,细胞浆透明,细胞核较大,呈椭圆形,通常含2 3个核,无自发性搏动。台盼兰拒染法计数，活细胞率达99%。免疫细胞荧光可见波形蛋白抗体呈阳性，肌动蛋白抗体呈阴性，CFs纯度达95%,见图1。心脏成纤维细胞免疫荧光鉴定

　　2.2  PPARα激动剂对CFs增殖的影响  与对照组相比，苯扎贝特对CFs的增殖没有显著改变（P＞0.05），AngⅡ可明显促进CFs增殖（P<0.01）；与AngⅡ组相比，苯扎贝特＋AngⅡ组对细胞增殖没有明显改变（P＞0.05）；与苯扎贝特＋AngⅡ相比，MK886＋苯扎贝特＋AngⅡ组对细胞增殖没有明显差异（P＞0.05），见表2。表2  各组心脏成纤维细胞MTT的OD值

    *2.3  PPARα激动剂对CFs目的基因表达的影响  使用AlphaEaseFC凝胶分析系统可测知扩增条带代表的片段大小与预先设计相符。与对照组相比，AngⅡ组CFs CollagenⅠ、TIMP1 mRNA的表达明显增加，MMP2 mRNA表达减少（P<0.01）；与AngⅡ组比较，苯扎贝特＋AngⅡ 组CFs CollagenI、TIMP1 mRNA的表达明显受到抑制，MMP2 mRNA表达增加（P<0.01），并在10－7 10－5mol/L呈剂量依赖性（P<0.01）；与苯扎贝特＋AngⅡ组比较，MK886＋苯扎贝特＋AngⅡ组CFs CollagenⅠ、TIMP1 mRNA的表达明显增加，MMP2 mRNA 表达降低（P<0.01），见图2、图3。 苯扎贝特对AngⅡ诱导的胶原代谢相关基因表达的剂量效应

    3  讨  论

    高血压心肌肥厚主要表现为心肌细胞肥大、CFs增殖以及ECM沉积。心脏成纤维细胞是胶原合成和降解最主要的细胞，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维是心肌细胞外基质的主要成分，约占2/3［3］，而胶原的降解主要是由MMPs和TIMP来调节的［4］。MMPs属于蛋白酶家族，降解ECM蛋白，在心脏ECM重构中起重要作用，其在组织中主要以非活性形式存在；TIMP是MMPs内源性组织抑制因子，调节MMPs的表达和活性；MMPs和TIMP之间的平衡决定着心肌细胞外基质的组成和分子结构［5］。AngⅡ通过AT1受体促进CFs合成胶原和TIMP1的表达，同时抑制MMP2的活性［6］，有致纤维化的作用［7］。本试验用AngⅡ刺激CFs后，collagen Ⅰ、Ⅱ MP1表达明显增加， MMP2 mRNA表达减少，与文献报道的一致［6,7］。

    PPARs是核受体超家族中配体激活的核转录因子， PPARs家族主要包括三种蛋白亚型：PPARα，PPARβ，PPARγ。PPARs广泛参与脂质和糖代谢以及细胞的增殖分化与凋亡，其天然配体有脂肪酸、氧化脂肪酸等。贝特类调脂药是PPARα的合成配体即激动剂，与PPARα结合再与视黄醛X受体（retinoic X receptor, RXR）一起，形成一种复合物，后者与过氧化酶体增殖物反应元件（peroxisome proliferator response element, PPRE）结合，调控靶基因的转录［8］。从本研究结果可见，PPARα激动剂苯扎贝特可以抑制AngII诱导的CFs胶原I的转录，减少ECM的生成；