胎儿脐动脉血管平滑肌细胞贴块培养方法的改进

作者:徐会圃,窦晋景,齐超 作者单位：1 滨州医学院附属医院心内科 滨州市 256603；2 贵阳医学院；3 邹平人民医院心内科

     【摘要】  目的 探讨胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的培养方法。方法 取无菌新鲜健康孕妇胎儿脐动脉，采用组织贴块法培养血管平滑肌细胞，并用αactin肌动蛋白免疫组化方法对培养的细胞进行鉴定。结果 运用此方法成功地培养出胎儿脐动脉血管平滑肌细胞，培养的细胞呈典型的“峰谷”样生长特性，用抗平滑肌α肌动蛋白(αactin)的单克隆抗体做免疫组化检测，低倍镜下可见细胞普遍呈阳性反应，高倍镜下可见αactin肌动蛋白在胞浆内均匀分布。结论 此方法取材容易，操作简单，费用低廉，为人动脉血管平滑肌细胞的培养提供了一种实用、可靠的方法。

【关键词】  脐动脉；平滑肌细胞；细胞培养

基金资助项目：滨州医学院科研启动基金BY2005KYQD17

    The improvement of culture human vascular smooth muscle from fetus umbilical artery by explant attached method

    XU Huipu DOU Jinjing QI Chao

    Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】 Objective To explore the culture techniques of fetus umbilical artery vascular smooth muscle cells. Methods The human vascular smooth muscle cells were cultivated using the fetus umbilical artery by the explant attached method in vitro, and identified by immunohistochemical methods. Results The fetus umbilical artery vascular smooth muscle cells were cultured successfully by using the method. The cells grew into the typical "hillvalley" characteristic They were identified by immunohistochemical methods of anti αactin, it proved that all cells almost were vascular smooth muscle cells.Conclusion This method is easy, convenient and cheap. It provides a useful and reliable method for culture of human vascular smooth muscle cells.

    【Key words】 umbilical artery,smooth muscle cell,cells culture

    动脉血管平滑肌细胞的体外培养始于20世纪70年代，由Ross［1］和Chamley［2］用组织贴块法培养成功。此方法的运用和发展为研究某些心血管疾病的发病机制及其防治工作提供了重要的研究手段。笔者参考国内外最新的研究报道［3~5］，并进行了适当的改进，使这一方法更简便、有效地为实验提供了足量的细胞。

    1 材料与方法

    11 主要实验试剂 青霉素（Lot:L050508 山东鲁抗医药股份有限公司）；链霉素（Lot:05121701 山东瑞阳制药有限公司）；HEPES（Lot:BB0367 SABC 华美）；DMEM培养基（Lot:AQF24023DC Gibco公司）；特级胎牛血清（Lot：051105C1081 天津市灏洋生物制品科技责任有限公司）；胰蛋白酶（华美公司）；抗平滑肌α肌动蛋白(αactin)的单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

    1.2 胎儿脐动脉血管平滑肌细胞培养与鉴定方法

    1.2.1 细胞分离与原代培养：无菌条件下在产房内取健康新生儿脐带（5~10 cm），置入放有DMEM培养液（含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）的无菌离心管中带回实验室，放入无菌培养皿于超净工作台上分离出脐动脉，用DMEM培养液反复冲洗，以去掉血管内外的血迹，用眼科镊小心分离下动脉外的结缔组织及血管外膜，然后用眼科剪纵向剪开血管，再用眼科剪将中膜和内膜剪成约1~2 mm2大小的组织块，用弯头吸管将血管小块移入25 cm2塑料培养瓶,并以4~7块/cm2的密度均匀排列于培养瓶底（培养瓶底提前用培养液湿润），翻转后加入含有青霉素和链霉素及20%胎牛血清的DMEM培养液约3~5 ml，放入37℃、5%CO2培养箱内(湿度100％)，贴壁2~3 h后再轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入到培养液中，开放式培养，一周后取出观察并换液。

1.2.2 胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养：细胞生长融合后，用0.125％的胰蛋白酶消化传代。先将胰蛋白酶放入37℃水浴箱预热。用吸管将组织块从培养瓶底轻轻吹打下来，可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养。用无血清的培养液将培养瓶底冲洗两遍，洗掉残留的血清，然后迅速加入预热的胰蛋白酶，放回培养箱，每隔2 min观察一次，并轻轻拍打培养瓶壁，使细胞从瓶底脱落下来，待镜下观察多数细胞收缩变圆后，向培养瓶中加入含血清的培养液，终止胰蛋白酶的作用，再用吸管轻轻吹打培养瓶底，使细胞脱落，然后将培养瓶中的液体移入离心管，500 r/min，离心10 min后，弃上清液，然后加入含有10％胎牛血清的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液，按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶，放回培养箱继续培养。

    1.2.3 血管平滑肌细胞的鉴定：取常规传代的细胞，制成均匀的细胞悬液后，移入放有盖玻片的培养皿中培养，待细胞贴壁伸展，生长良好后取出盖玻片，用PBS冲洗2遍，凉干，放入4%的多聚甲醛中固定，30% H2O2 1份+纯甲醇50份混合，灭活内源性过氧化物酶，然后热修复抗原，再分别滴加5%BSA封闭液﹑一抗［即抗平滑肌α肌动蛋白(αactin)的单克隆抗体］﹑生物素化山羊抗小鼠IgG﹑试剂SABC，最后DAB显色，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

    2 结果

    2.1 体外培养的胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的形态观察 实验中观察到脐动脉组织块贴壁后5~7 d可见有细胞以垂直方向从组织块周围游走出来（见图1），但并不是所有的组织块周围都有细胞游出，离组织块较远的区域也可以看到细胞，此为平滑肌细胞的漂移性生长特性（见图2），细胞形态多样，大小不一，多为长梭形、菱形或星形；9~11 d细胞进入对数生长期，细胞生长加速，部分区域可见“峰谷”样生长（见图3）；约2周左右细胞融合成片，甚至相互交叉生长形成多层可以进行传代培养。细胞用胰蛋白酶消化后呈圆形，传代接种于培养瓶4 h就有细胞贴壁，24 h后细胞伸展，细胞形态多样，胞浆丰富，仍然呈“峰谷”样生长特性，细胞生长较快，5~7 d长满瓶底，可以进行传代。

    2.2 细胞鉴定结果

    2.2.1 倒置显微镜下观察：细胞多数呈长梭型，并可见典型的“峰谷”样生长特性，此为平滑肌细胞贴壁生长的特征性之一。

    2.2.2 免疫组化：按常规方法制片，经αactin（肌动蛋白）免疫组化染色后，低倍镜下可见细胞普遍呈阳性反应(见图4)，高倍镜下可见αactin（肌动蛋白）在胞浆内均匀分布。

    3 讨论

    本实验取材于脐动脉，采用贴块法成功培养出平滑肌细胞。脐动脉是中动脉，中膜中唯一的细胞是平滑肌细胞，内膜中唯一细胞的是内皮细胞，实验中只去除血管外膜，保留中膜和内膜，将中膜和内膜一起培养，摒弃了传统平滑肌细胞培养实验中单纯培养动脉中膜的模式，将平滑肌细胞和内皮细胞联合培养，不但节约了接种时间，而且减轻了对平滑肌细胞的机械损伤，更有利于原代细胞的游出。本实验将去掉内膜的组织块与未去掉内膜的组织块同时培养，比较发现，未去掉内膜的组织块首先游走出细胞，而去掉内膜的组织块生长周期很长，甚至组织块死亡，没有细胞游出。在原代培养时，可以看到内皮细胞从组织块中游走出来，但随着原代培养的进行，内皮细胞不断的被平滑肌细胞所覆盖，又因在传代过程中，内皮细胞处于最底层而不易被消化下来，所以内皮细胞被淘汰，平滑肌细胞得到纯化。另外，脐动脉为中动脉，内膜中的内皮是单层扁平上皮，很薄，只由一层内皮细胞组成，而中膜较厚，由10~40层环行排列的平滑肌细胞组成，显然，平滑肌细胞的数量占有绝对优势；而且参考相关资料和文献［6，7］，发现内皮细胞的培养大多数用酶解法，没有用贴块法的，因此，不用担心此方法培养平滑肌细胞会被内皮细胞污染。实验中发现，平滑肌细胞对温度要求特别严格，培养箱内的温度必须为（37±0.5）℃，而成纤维细胞在（35±0.5）℃就可以生长。另外，在原代培养中组织块的密度要尽量大，因为组织块之间可以产生微量的相互作用；而且所用的眼科剪必须锋利，以减少对组织块的机械损伤，还可以保持组织块周围的整齐，利于细胞游走出来。在原代培养换液时，为避免将组织块晃动下来，可以先将培养瓶翻转过来，换液完成后再将培养瓶翻转。在传代时，必须把胰蛋白酶的温度控制在37℃，使其活性最大，保证最大程度地把细胞消化下来。

【参考文献】  ［1］ Ross R.The smooth muscle cell Ⅱ. Growth of smooth muscle cells in culture and formation of elastic fibers［Ｊ］. J Cell Biol, 1971,50(1):172176.

［2］ Chamley CJ, Campbell GR, Ross R. The smooth muscle cells in culture［J］. Physiol Rev, 1979,59:161.

［3］ 王海燕，贾国良，张荣庆，等.与人脐静脉内皮细胞共培养的人脐动脉平滑肌细胞生物学特性研究［J］.中国临床康复,2004,8(12):22582259.

［4］ Di Luozzo G, Bhargava J, Powell R J. Vascular smooth muscle cell effect on endothelial cell endothelin1 production［J］. J Vasc Surg，2000,31(4):781789.

［5］ 于学军,何作云,王晓燕,等.平滑肌细胞双层联合培养模型的改进［J］.第三军医大学学报,2004,26(6):554556.

［6］ 鄂征.组织培养［M］.北京:北京出版社,2001：2930.

［7］ R.I.弗雷谢尼著.章静波,徐存拴译.动物细胞培养——基本技术指南［M］.第4版.北京:科学出版社,2004:450451.