柯萨奇病毒B3致病毒性心肌炎动物模型的建立

作者:李岳春,杨占秋 作者单位：温州医学院第二附属医院 心内科，浙江 温州 325000；

    【关键词】  病毒性心肌炎 物模型 柯萨奇病毒

    病毒性心肌炎的治疗一直是临床工作者非常关注的问题[1]。建立一个稳定而可靠的病毒性心肌炎动物模型，对治疗心肌炎的药物筛选及药效研究是必不可少的，心肌炎动物模型可以提供明确的病原，进行全面的心肌病理检查，适用于临床与基础研究。我们在观察各种药物治疗柯萨奇病毒（CVB3）模型鼠的作用中(另文报告)，首先进行了CVB3的致病模型研究，现报告如下。             

    1  材料和方法

    1.1  实验动物与分组  4周龄雄性近交系BALB/C小鼠，体重(17±2) g，购于湖北省实验动物研究中心，所有小鼠均为SPF级。将35只小鼠分为2组：A组为实验组25只，B组为正常组10只。

    1.2  细胞与病毒株  Hep2细胞由武汉大学典型培养物保藏中心提供。CVB3 Nancy株为武汉大学医学院病毒学研究所保存。病毒经Hep2细胞活化增殖，CPE达75%以上时收获,其滴度为107TCID50/0.1 ml。

    1.4  模型建立  动物室保持空气流通，相对湿度在60%左右，温度(22±2)℃。注射部位常规消毒后，腹腔注射10-5即100TCID50/0.1 ml CVB3 0.1 ml，正常组腹腔注射等量0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液0.1 ml。接种病毒时间定为第0天，至第7天时随机从各组取5只小鼠，于眼眶采血后处死小鼠留取心脏，将血离心分装、血浆冻存，将心脏冲洗称重后，用10%甲醛固定待做病理组织学检查，剩余小鼠饲养至第21天时，全部处死留取心脏，将心脏冲洗称重后，用10%甲醛固定待做病理组织学检查。

    1.5  心脏重量/体重（HW/BW）比值与生存率  存活达第21天者视为存活，各组小鼠处死之前称重，心脏称重前用滤纸吸净。

    1.6  组织病理学检查  各组小鼠用10%甲醛固定后石蜡包埋切片，HE染色,镜下观察组织病理学改变并记分。炎症细胞浸润，心肌坏死占每张心脏切片<25%（+）计1分，25%～50%（++）计2分，50%～75%（+++）计3分，>75%计4分。

    1.7  血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)的生化测定  采用TOSHIBA-40FR自动生化分析仪测定血清CK-MB的含量。

    1.8  统计学处理方法  率的比较用x2检验，组间计量资料采用ｔ检验。

    2  结果

    2.1  HW/BW比值与生存率  A与B组HW/BW比值结果分别为（0.0068±0.0006）和（0.0049±0.0001），两组比较P＜0.01，差异有统计学意义。A组20只小鼠，21 d生存率为45.00%（死亡11只），第1～第6天共死亡2只，而第7～第12天死亡8只，第13～第21天仅死亡1只，死亡高峰在第7～第12天；B组无一只死亡。

    2.2  病理学检查结果  A组小鼠心脏外膜肉眼可见少量白色点状、条纹状、斑块状以及出血点等。B组无此现象。CVB3感染小鼠后第7天炎症细胞灶性浸润，分布在溶解坏死的心肌周围(见图1)，更有意思的是发现大量淋巴细胞围绕神经组织浸润(见图2)。

    2.3  组织学检查结果  第7天时从各组随机抽取5只小鼠光镜检查，发现A组小鼠心肌均有变性、坏死、炎症细胞浸润或有钙盐沉着，组织评分最低分为2.1分，最高分为4分；B组未发现炎症细胞浸润与心肌坏死。

    2.4  心肌酶CK-MB结果  第7天时A组小鼠为(188.5±35.6)U/L，B组为(45.3±11.2)U/L，两组比较 P＜0.01。

 3  讨论

    本实验证明: Balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒可导致严重的心肌炎症。心脏的病理与组织学表现与国内外[2，3]报道基本一致。

    Balb/c小鼠对嗜心肌病毒极具敏感性，腹腔接种CVB3心肌炎诱发率可达100%[2]。本实验接种病毒小鼠心脏大体解剖可见心外膜心肌100%地出现白色点状、斑块状或者条纹状改变，病理切片均证实心肌存在严重病变。本实验在第7天时从各组中随机抽取5只小鼠进行光镜检查,发现A组小鼠炎症细胞浸润主要是淋巴细胞、单核细胞和少量的中性粒细胞，和熊丁丁等[4]报道相吻合。更有意思的是我们发现炎症细胞围绕心脏神经组织浸润较多见，多为单核淋巴细胞。

    现在认为病毒对心脏的直接侵犯和机体的免疫反应是病毒性心肌炎的主要发病机制——受损的心肌细胞引起机体自身免疫反应，即炎症细胞对正常心肌细胞进行攻击，引起心肌细胞死亡及心肌病理变化[5]。同时，病毒感染心脏后，可诱导大量炎症细胞因子产生。干扰素家族[6]、白细胞介素家族[7]、肿瘤坏死因子[8]等均参与心肌炎的发病发展过程。众所周知，炎症细胞以及细胞因子有助于清除病毒，但同时对心肌有损伤作用，其最终意义在于其有利与不利作用的强弱对比。

    我们将心肌炎小鼠用于药物疗效研究，发现模型的重复性与稳定性好，效果令人满意。本心肌炎动物模型可用于研究心肌炎的自然病程以及药物治疗心肌炎的疗效及其作用机制。

【参考文献】  [1] Zaidi SH , Hui CC,Cheah AY, et al. Targeted overexpression of elafin protects mice against cardiac dysfunction and mor- tality following viral myocarditis[J]. J Clin Invest, 1999, 103 (8): 1211-1219.

[2]杨英珍.病毒性心脏病[M]. 上海:上海科学技术出版社,2001. 52-56.

[3]Woodruff JF. Viral myocarditis: A review[J]. Am J Pathol, 1980, 101 (2): 427-479.

[4]熊丁丁,杨英珍.穿孔素与病毒性心肌炎[J]. 国外医学(心血管病分册),1996, 23 (3): 134-136.

[5]Martin R,Bennett. Apoptosis in the cardiovascular system[J]. Heart, 2002, 87(5): 480-487.

[6]Horwitz MS,La-Cava A,Fine C,et al. Pancreatic expression of interferon-gamma protects mice from lethal coxsackievirus B3 infection and subsequent myocarditis[J]. Nat Med, 2000, 6(6): 693-697.

[7]Tanaka T, Kanda T, McManus BM, et al. Overexpression of interleukin-6 aggravates viral myocarditis:impaired increase in tumor necrosis factor-α[J]. J Mol Cell Cardiol, 2001,33 (9): 1627-1635.

[8]Wada H,Saito K,Kanda T,et al.Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) plays a protective role in acute viral myocardi- tis in mice-A study using mice lacking TNF-alpha[J]. Circulation, 2001, 103 (5): 743-749.