经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死的临床研究

作者:施海明 

作者单位：复旦大学附属华山医院心内科，上海 200040              【摘要】  采用随机、对照、前瞻性的临床试验，评价经冠状动脉自体骨髓单个核细胞(BMMNCs)移植治疗急性前壁心肌梗死的有效性和安全性。方法 入选26例急性前壁心肌梗死患者，BMMNCs移植组(14例)行经皮冠状动脉介入（PCI）治疗联合经冠状动脉自体BMMNCs移植；对照组(12例)接受PCI治疗。结果 3个月后，BMMNCs移植组左室射血分数(LVEF)由(54.29±5.47)%提高至(59.21±5.54)%(P<0.05)，与对照组比较，无统计学差异(P＞0.05)；PET/CT示BMMNCs移植组心肌18FFDG代谢显像明显改善；明尼苏达生活质量评分的改变亦具有统计学意义。结论 经冠状动脉自体BMMNCs移植治疗急性前壁心肌梗死安全而有效，可能与BMMNCs转分化为心肌细胞改善心功能有关。

    【关键词】  心肌梗死 细胞移植 心肌再生 骨髓 正电子发射断层扫描

    Clinical study of autologous intracoronary bone marrow mononuclear cells transplantation in acute anterior myocardial infarction treatment   SHI Haiming, JIN Bo, CHANG Xifeng, LUO Xinping, ZHU Jun, LI Yong, SHEN Wei, LI Jian, WANG Caiping. Department of Cardiology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

    Abstract：Objective  To evaluate the efficacy and safety of autologous intracoronary bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) transplantation in acute anterior myocardial infarction (MI) treatment.   Methods  Twentysix patients with acute anterior MI were included. After emergency percutaneous coronary intervention (PCI) for the guilty coronary artery, 14 patients were transplanted with autolougous BMMNCs （BMMNCs group）via coronary artery. The other 12 patients were taken as control.  Results  After 3 months of followup, left ventricular ejection fraction (LVEF) increased significantly in BMMNCs group [from (54.29±5.47)% to (59.21±5.54)%, P<0.05]; while when compared with control group, there was no statistical significance (P>0.05). Positron emission tomography (PET)/CT demonstrated significant 18FFDG myocardial metabolism imaging improvement after transplantation of autologous BMMNCs. Minnesota living with heart failure questionnaire indicated significant improvement in BMMNCs group compared with control group.  Conclusions  Autologous intracoronary BMMNCs transplantation for acute anterior MI treatment is safe and effective. The underlying mechanism may result from the differentiation of BMMNCs into myocardial cells.

    Key words：  Myocardial infarction;  Cell transplantation;  Myogenesis;  Bone marrow;  Positron emission tomography

　　 急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）后,骨髓释放干/祖细胞的能力自然上调,到达缺血区域并分化为心肌细胞和血管内皮细胞，但该过程尚不能代偿心肌细胞的丢失[1,2]。将心外组织中具备分化潜能的各种干细胞导入，修复受损心脏功能，有望成为治疗心肌梗死后心力衰竭最直接、最有效的途径。本研究采用随机、对照、前瞻性的临床试验,旨在评价经冠状动脉自体骨髓单个核细胞(mononuclear bone marrow cells，BMMNCs)移植治疗急性前壁心肌梗死的有效性和安全性，并初步探讨其内在机制。

　　1  对象和方法

    1.1  研究对象

    2005年5月至2006年11月，共入选26例ST段抬高的急性前壁心肌梗死患者，随机分组，接受静脉溶栓治疗7～10 d后，BMMNCs移植组(14例)行经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention， PCI）术联合经冠状动脉自体BMMNCs移植；对照组(12例)接受PCI治疗,临床随访3个月。入选标准：ST段抬高的急性前壁心肌梗死；经选择性冠状动脉造影评估PCI优于冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）；患者同意该项治疗并在知情同意书上签字。排除标准：恶性肿瘤；药物无法控制的致命性室性心律失常；超声心动图证实存在附壁血栓或室壁瘤；严重肝肾功能不全；感染；碘剂或麻醉剂过敏。本研究方案经复旦大学附属华山医院伦理委员会讨论并批准。

    1.2  试剂和仪器

    淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）,输血器（型号TSⅢ,上海输血技术有限公司），水平式低温离心机（Eppendorf 5810R，德国），超净工作台（上海淀山湖净化设备厂），光学显微镜（OLYMPUS BH2，日本），CD133和CD34单抗（Miltenyi Biotec,德国），流式细胞仪（FACS，美国），彩色心脏超声诊断仪（PHILIPS 3500，荷兰），正电子发射断层扫描（PET/CT）（西门子公司Biograph Sensation 16），数字减影血管造影仪（PHILIPS，荷兰）。

    1.3  研究方法

    1.3.1  BMMNCs分离纯化  PCI术当天,开放静脉通路，选取左髂后上棘为穿刺点，常规消毒铺巾，2%利多卡因局部麻醉，骨穿针垂直进入骨髓腔（多点穿刺），用预先装有10 ml肝素生理盐水（500 ml生理盐水加入50000 U肝素钠）的60 ml注射器（4支）抽吸骨髓液，共采集40 ml×4=160 ml混有肝素盐水的骨髓液。用孔径为0.02 mm的输血器过滤两次，以3500 r/min在4℃条件下离心5 min,将骨髓细胞悬液沿管壁等体积加在淋巴细胞分离液中，以2500 r/min离心20 min，吸取云雾层，以肝素生理盐水洗涤2次（1500 r/m，5 min）,细胞团块以肝素生理盐水悬浮，充分混匀。

    1.3.2  质量控制  取BMMNCs悬液0.5 ml，行流式细胞术检查,计数BMMNCs，测定CD133+和CD34+细胞比例；台盼兰染色评价细胞活力。

1.3.3  经冠状动脉自体BMMNCs移植  常规心电监护和压力监护,行选择性冠状动脉造影，针对靶病变行PCI术,Maverick2 OTW球囊置于前降支近端，低压充盈，将BMMNCs悬液(15±2) ml，经球囊导丝腔缓慢注入，历时2～3 min，造影确认冠状动脉血流未受影响,返回监护室，即刻、6、24 h常规心电图和心肌酶谱测定。

    1.3.4  有效性评价  术前/术后3个月，应用彩色心脏超声诊断仪完成心脏超声检查，采集图像，患者取左侧卧位，获取4个标准的二维图像（胸骨旁长轴、短轴和心尖两腔、四腔切面），图像分析由两名经验丰富且不了解试验分组的心脏超声专科医生独立完成，采用Simpson方法测量左室射血分数（LVEF）；静息状态下,口服葡萄糖溶液，调整血糖为（8.93±0.64）mmol/L,经静脉注射 18FFDG 10mCi，30 min后行心肌代谢显像，采集短轴、水平长轴及垂直长轴的图像，评价细胞移植前后的分子影像学改变；明尼苏达心力衰竭问卷[3]评价患者生活质量。

    1.4  统计学处理

    用SPSS 12.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差（±s）表示,组间比较采用独立样本t检验,治疗前后比较采用配对资料t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

    2.1  基线资料

    BMMNCs移植组与对照组的基线资料无统计学差异(表1), BMMNCs移植组均行流式细胞术检查,计数BMMNCs(6.27±1.75)×107，CD133+和CD34+细胞比例分别为（0.36±0.11）%和（0.69±0.13）%；细胞活力(94.74±1.34)%。

    2.2  有效性评价

    术前/术后3个月超声心动图示BMMNCs移植组LVEF由(54.29±5.47)% 提高至(59.21±5.54)%(P＜0.05)，与对照组比较则无统计学差异,心脏几何参数改变亦无统计学意义；明尼苏达生活质量评分的改变具有统计学差异(表2)。

    2.3  分子影像学

    受到研究经费的限制，BMMNCs移植组和对照组各6例完成术前/术后3个月PET/CT检查。急性前壁心肌梗死 18FFDG心肌代谢显像表现为前壁及心尖部放射性摄取缺损，梗死边缘带放射性摄取减低,经冠状动脉自体BMMNCs移植3个月后, PET/CT示细胞移植组原缺损区部分放射性填充，心肌梗死边缘带放射性摄取明显改善(图1)。  表1  基线资料的比较 注：两组基线资料比较 P＞0.05表2  BMMNCs移植组和对照组心功能的评价 注： SV：每搏输出量；LVIDs：左心室收缩未期内径；LVIDd:左心室舒张未期内径；LVPWd：左室后壁舒张未期厚度

    BMMNCs移植前后比较， aP＜0.05，与同期对照组比较， bP＜0.05

    2.4  安全性评价

    返回监护室即刻、6 h、24 h心电图未见致命性心律失常；心肌酶学指标的改变无统计学意义。3  讨论

    AMI导致大量心肌细胞丢失、神经内分泌激活、炎症反应和心肌超负荷,静脉溶栓和PCI治疗尚无法完全阻断心室重构的病理生理进程，最终发展为充血性心力衰竭。细胞心肌成形术是通过干细胞移植的方法修复受损心脏，有望成为治疗心肌梗死后心力衰竭最直接、最有效的途径。初步临床试验证实骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏病的有效性和安全性[4,5], 亦有部分学者对骨髓干细胞的横向分化能力提出质疑[6,7]，尚需要多中心、随机双盲、前瞻性大样本临床试验加以论证。

    BMMNCs移植术后3个月，超声心动图示细胞移植组LVEF提高，而心脏几何参数改变无统计学差异，推测尽管经冠状动脉自体BMMNCs移植可能通过修复坏死心肌而改善左心室收缩功能，但无法从根本上逆转左室重构的病理生理进程。NYHA心功能分级和明尼苏达生活质量评分主要依据心力衰竭患者临床表现进行，随着医学模式的转变，生存质量的综合评估在心力衰竭患者中的应用日益广泛，明尼苏达生活质量评分作为较为客观的评价手段，可以总体反映心力衰竭患者的生存质量。

    PET是目前唯一用解剖形态学方式显像的分子影像学诊断技术，是临床评估心肌活力的“金标准”，通常将心肌PET显像分为心肌灌注显像、心肌代谢显像和心肌受体显像[8]。2002年PET/CT应用于临床，弥补了PET空间分辨率的不足，并使图像质量进一步提高。目前PET示踪经冠状动脉途径移植后干细胞的归巢和生物学分布已成为研究热点[9,10]。本研究应用PET/CT评价BMMNCs移植后心肌代谢显像的改变，对照组 18FFDG心肌代谢显像示左心室前壁及心尖部放射性摄取缺损区仍存在，而BMMNCs移植组原缺损区部分放射性填充，心肌梗死边缘带放射性摄取明显改善，提示该区域存活心肌细胞数目增多，间接证实经冠状动脉自体BMMNCs移植可能是通过转分化为心肌细胞而改善心功能。由于缺乏相应的软件包，目前尚无法精确量化梗死心肌面积。

    本研究提示,经冠状动脉自体BMMNCs移植治疗急性前壁心肌梗死，可以改善临床症状，安全可行，可能为梗死区的组织再生和功能重建提供有效的治疗策略,但样本量较小,移植后远期疗效的评价尚在随访中，其确切机制亦有待于进一步研究。

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