心肌内移植自体骨髓单个核细胞治疗急性心肌梗死的实验研究

作者:孙林 

作者单位：昆明医学院第二附属医院心血管内科，云南省冠心病基础研究室，云南 昆明650101            【摘要】  探讨心肌内移植自体骨髓单个核细胞（BMMNCs）治疗猪急性心肌梗死的有效性和安全性。方法 11只小型猪分为两组：BMMNCs组（n=6）和对照组（n=5）。心肌内移植BMMNCs后4周观察移植细胞归巢情况、小血管密度、心功能及冠脉侧支血管形成情况及可能发生的不良反应。以超声心动图评价心室结构及功能变化。结果 心肌内MNCs移植后4周心肌细胞间可见发蓝色荧光的移植细胞，心肌细胞间有较多新生毛细血管并可见新生的心肌样细胞。移植组小血管密度、左室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS)明显高于对照组（P<0.01）而左室舒张末期内径(LVEDd)低于对照组（P<0.05）。移植组冠脉侧支循环形成较对照组明显。心肌内移植MNCs没有发现异常增生、钙化或肿瘤形成。结论 心肌内移植BMMNCs有较多的移植细胞归巢到宿主心肌，有助于促进缺血心肌血管新生，有改善左室收缩及舒张功能，减轻心室重构的作用。

    【关键词】  骨髓单个核细胞 移植 急性心肌梗死 猪

    Experimental study of autologous bone marrowderived mononuclear cells intramyocardial transplantation into ischemic myocardium in acute myocardial infarction swines   SUN Lin1, ZUO Mingxian1, HUANG Guiqin2, LI Jingsong3, ZHANG Ge1, ZHOU Xu1, ZHANG Tiling1, LU Di2, GUANG Xuefeng1, YANG Dakuan1.1.Department of Cardiology, 2nd Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650101; 2.Institute of Neurology, Kunming Medical College, Kunming 650031; 3.Cardiac center, 2nd People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, China

    Abstract：Objective  To evaluate the efficacy and safety of bone marrowderived mononuclear cells (BMMNCs) intramyocardial transplantation in acute myocardial infarction (AMI) swine.  Methods  Eleven swines were divided into 2 groups: BMMNCs group (n=6) and control group (n=5). Immediately after the myocardial infarction model was made, BMMNCs or saline was injected directly into the ischemic myocardium around the infarct. Four weeks after implantation, BMMNCs homing, blood vessels density in the ischemic myocardium, heart function, collateral circulation formation and adverse events were observed.  Results  In the BMMNCs group, many blue fluorescence cells can be detected in host myocardium. Many newborn capillary vessels and a few new Cardiomyocytelike cells were observed. Blood vessels density , left ventricular ejection fraction (LVEF)and fraction shortening of short axis (FS) in BMMNCs group were significantly higher than in control group (P<0.01). Left ventricular enddiastolic dimension (LVEDd) was lower in BMMNCs group than in control group (P<0.05). Rich collateral vasculatures in BMMNCs group were observed. No adverse events such as abnormal angiogenesis, calcification or cancer were observed.  Conclusions  BMMNCs can home to host myocardium, induce angiogenesis, improve cardiac function and attenuate remodeling of the left ventricle after myocardial infarction.

    Key words：  Bone marrowderived mononuclear cells;  Transplantation;  Acute myocardial infarction;  Swine

     既往的研究认为心肌细胞不能再生，心肌梗死后，瘢痕形成及心肌重构，最终导致心力衰竭。目前的研究表明，移植的干细胞可以分化为心肌细胞，并能分泌多种生长因子诱导新的血管形成[1]，使心肌梗死瘢痕区血管和心肌再生。国内应用干细胞移植治疗急性心肌梗死的研究大多选用小鼠和兔，本研究实验动物选用小型猪，因为猪的冠脉分布及其特点与人非常相近，易于形成心肌梗死，且侧支血管生成能力非常有限，能形成稳定的缺血区。本研究采用心肌内直接注射骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）到小型猪缺血心肌，探讨BMMNCs治疗急性心肌梗死的有效性和安全性。

1  材料和方法

    1.1  BMMNCs的提取、分离和标记

    无菌条件下穿刺小型猪髂后上嵴，抽取骨髓20～40 ml。采用密度梯度离心法分离BMMNCs，调整细胞密度为2×108/ml，制成干细胞悬液1 ml，保存备用。取样进行台盼蓝染色检测细胞存活率。移植前加入浓度为50 μg/ml的DAPI染色标记，保存于4℃冰箱，染色标记后1 h内移植。

    1.2  制备小型猪急性心肌梗死模型

    小型猪11只，以戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉；无菌条件下开胸结扎左回旋支（LCX）主要分支，制成急性心肌梗死模型[2]。

    1.3  实验分组及BMMNCs移植方法

    小型猪11只，分为两组即心肌内移植BMMNCs组（n=6）及心肌内盐水对照组(n=5)。心肌内移植BMMNCs组：制成急性心肌梗死模型后即刻在梗死区周围的缺血心肌内注射自体BMMNCs细胞悬液1 ml，细胞数2×108；心肌内盐水对照组：制成急性心肌梗死模型后即刻在梗死区周围的缺血心肌内注射Hanks平衡盐溶液1 ml。

    1.4  观察项目

    1.4.1  荧光显微镜检查  移植后4周达实验终点处死动物，于心肌梗死及其临近部位取材，制作冰冻切片，观察移植细胞的归巢情况。

    1.4.2  电镜检查  心脏标本以2%戊二醛固定进行电镜观察心肌超微结构，是否有新生的心肌细胞。

 1.4.3  病理组织学检查  移植后4周达实验终点处死动物，取心脏标本，10%福尔马林固定，石蜡包埋、切片，用兔抗人Ⅷ因子进行免疫组化染色，光镜下每张切片随机计数10个高倍视野（100×），分别计数小血管密度（直径<50 μm），观察血管新生情况。取肝肾脾肺组织行病理切片，观察是否有异常组织增生、钙化、肿瘤形成。

    1.4.4  超声心动图检查  分别于心肌梗死模型术前及MNCs移植后4周行超声心动图检查。测量左室舒张末期内径（left ventricular enddiastolic dimension, LVEDd）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）、短轴缩短率（fraction shortening of short axis, FS）、室间隔厚度(interventricular septum thickness,IVST)及左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness, LVPWT），评价左室收缩功能及心室重构情况。

    1.4.5  冠状动脉造影检查  心肌内BMMNCs移植后4周及对照组术后4周分别行冠状动脉造影检查，观察冠状动脉侧支血管形成情况。造影术中监测左室舒张末压（left ventricular enddiastolic pressure, LVEDP）。

    1.5  统计学处理

    所有数据采用SPSS11.0软件进行处理,计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析和均数间两两比较的方法，两样本均数的比较采用t检验，以P<0.05有统计学意义。

2  结果

    2.1  动物情况

    心肌内移植BMMNCs组死亡1只动物，模型制备过程中死于室颤。

    2.2  荧光显微镜观察

    心肌内BMMNCs移植后4周心肌细胞间可见发蓝色荧光的移植细胞，呈片状分布，表明经DAPI标记的MNCs细胞归巢到宿主心肌（图1）。      

    2.3  电镜检查

    对照组可见肌原纤维间隙增宽，肌丝断裂。心肌内BMMNCs移植组在梗死边缘区可见不成熟的心肌样细胞，胞核较小，核形态幼稚，心肌细胞间可见较多新生毛细血管（图2A，2B）。

    2.4  病理组织学检查

    对照组HE染色可见部分心肌细胞坏死溶解（图3A）。正常组见图形B。Ⅷ因子免疫组化染色（F8）观察血管密度（图3C，3D），移植组小血管密度为[（91.13±11.04）条/mm2] ，心肌内盐水对照组小血管密度为[（46.33±8.21）条/mm2]，移植组小血管密度明显高于对照组（P<0.01）。

    2.5  超声心动图检查

    移植组移植后4周 LVEF及FS明显高于对照组，P<0.01，而LVEDd小于对照组，P<0.05； IVST 及LVPWT与对照组相比无统计学差异，P>0.05（表1）。表1  心肌内MNCs移植前及移植后4周心功能比较注：与对照组术后4周比较aP<0.01,bP<0.05 

    2.6  冠状动脉造影检查

    移植术后4周冠状动脉造影显示侧支循环形成较对照组明显。LVDEP对照组为（23.12±6.47）mm Hg，移植组为（9.34±4.85）mm Hg，移植组LVDEP明显低于对照组(P<0.01)。

3  讨论

    3.1  BMMNCs的归巢和分化

    近年来的实验研究表明骨髓干细胞在心肌局部有定向分化为心肌细胞的潜能[3]。1999年Tomita[4]等分离成年大鼠的骨髓细胞在体外用5氮胞苷培养，第7天时细胞形成肌管，并分化表达肌钙蛋白Ⅰ和肌凝蛋白重链等心肌细胞表型的细胞。 2001年 Orlic等[5]首次报道了骨髓干细胞可以分化为心肌细胞。

    本实验发现心肌内BMMNCs移植后4周心肌细胞间可见发蓝色荧光的移植细胞，呈片状分布，表明有较多的经DAPI标记的BMMNCs细胞归巢到宿主心肌。电镜观察到移植组在梗死边缘区有不成熟的心肌样细胞，胞核较小，核形态幼稚。以上结果表明BMMNCs移植到心肌中不仅可以归巢到宿主心肌，而且可分化为心肌样细胞，同时发现新生的细胞主要分布于心肌梗死的周边区域，完全正常的心肌组织和梗死区中央瘢痕区移植细胞较少，这种分布特点和文献报道是一致的[6]。可能的机制为：在心肌急性缺血期，由于缺血缺氧内皮细胞间产生间隙，组织产生大量趋化因子和黏附因子使干细胞归巢于缺血部位，缺血区有一定的血供，有利于移植细胞的定植和存活,瘢痕区血供较差，不利于移植细胞的存活和分化。

    3.2  心肌内BMMNCs移植有促进血管新生，改善心功能的作用

    目前有研究表明，心肌内直接注射BMMNCs可以使心肌梗死瘢痕区血管再生，改善缺血心肌血供，改善心脏功能[7，8]。

    本实验也得到了类似的研究结果。心肌内BMMNCs移植后4 周，移植组小血管密度明显高于对照组（P<0.01），冠状动脉侧支循环形成较对照组明显，表明心肌内BMMNCs移植可以促进缺血心肌血管新生，促进侧支循环的建立。

    本研究发现心肌内BMMNCs移植后4周LVEF及FS明显高于对照组，提示BMMNCs移植后可改善左室收缩功能，移植组LVDEP显著降低，明显低于对照组，提示BMMNCs移植后对左室舒张功能也有改善。移植组LVEDd 较对照组明显缩小，而IVST及LVPWT与对照组相比数值降低，但无统计学差异，提示BMMNCs移植后可减轻心室腔的重构，但对室壁的重构减轻不明显，可能与观察的时间较短有关。BMMNCs改善心功能可能的机制：（1）BMMNCs直接分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞,形成新的血管；或以自分泌或旁分泌的方式分泌促血管生长因子如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ，bFGF）及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）从而促进血管生长。（2）由于BMMNCs是一个含有多种干细胞成分的混合细胞群，和骨髓中某种纯化的细胞相比，可提供细胞之间相互依赖、分化的诱导微环境 [9]。（3）BMMNCs在心肌内存活并与心肌细胞间形成电收缩耦联而同步收缩。BM MNCs有较强的细胞因子分泌功能，可促进细胞增殖和血管形成。新生的血管可以促进侧支循环的建立，冠状动脉侧支循环形成和开放，可改善心肌缺血，并且可提高移植细胞的存活率，从而减轻心室重构并使心功能得到改善。

3.3  心肌内BMMNCs移植的时机

    本研究BMMNCs的移植时机选在心肌梗死急性期，是安全有效的。有研究表明，心肌梗死超急性期进行细胞移植，移植的干细胞可能通过释放一些细胞因子更有益于改善心肌缺血。黄榕翀等[10]的临床研究证实了这一点，研究者认为在心肌梗死24 h内及时恢复梗死相关动脉灌注，随后进行干细胞移植可能会在更早时间内保护濒死心肌细胞和重建受损的微环境，并且由于内皮细胞间隙增大以及炎症浸润和大量炎性介质包括趋化因子释放，梗死区及其周边毛细血管通透性升高，有利于骨髓干细胞通过毛细血管壁迁移到梗死心肌内。

    本研究初步证实了心肌内BMMNCs移植可分化为心肌样细胞，有助于促进血管新生，有促进冠状动脉侧支循环的建立，改善缺血心肌血供，改善心功能的作用。

【参考文献】  ［1］Pittenger MF, Mackay AM, Beek SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells [J]. Science, 1999, 284:143147.

［2］孙 林，熊国昌，光雪峰，等.开胸结扎猪冠状动脉建立急性心肌梗死动物模型的研究[J].昆明医学院学报，2006，27（3）：13.

［3］Beltrami AP, Urbanek K, Kajstura J, et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction [J]. N Engl J Med, 2001, 344:17501757.

［4］Tomita S, Li RK, Weisel RD, et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function [J]. Circulation, 1999, 100(suppl Ⅱ):247256.

［5］Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium [J]. Nature, 2001, 410:710715.

［6］Ciulla MM, Lazzari L, Pacchiana R, et al. Homing of peripherally injected bone marrow cells in the rat after experimental myocardial injury [J]. Haematologica, 2003, 88:614621.

［7］Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T,et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands and cytokines [J]. Circulation, 2001, 104:10461052.

［8］Kanamori T, Watanabe G, Yasuda T, et al. Hybid surgical angiogenesis: omentopexy can enhance myocardial angiogenesis induced by cell therapy [J]. Ann Thorac Surg, 2006, 81:160168.

［9］Szilvassy SJ, Bass MJ, Van Zant G, et al. Organselective homing defines engraftment kinetics of murine hematopoietic stem cell and is compromised by ex vivo expansion [J]. Blood, 1999, 93:1557 1566.

［10］黄榕翀，姚 康，邹云增，等.急诊经冠脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性下壁心肌梗死长期随访观察[J].中华医学杂志，2006，86：11071110.