FISH技术检测染色体p16位点异常与膀胱癌发生发展的关系

　　作者：马红爽 姚程 马克威 姜振宇 作者单位：吉林大学第一临床医院风湿科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 对比西方人群，探索在中国人群中染色体异常与膀胱癌发生、发展的关系。方法 实验组为初发膀胱移行细胞癌及术后复发癌和临床上高度怀疑泌尿系恶性肿瘤患者32例;对照组为正常人20例。实验组应用FISH及细胞学检测，对照组应用FISH建立阈值。结果 FISH 检测敏感度96.8%，特异度50%。细胞学检敏感度19.4%，特异度100%。实验组3、7、9p21及17号染色体多倍体发生率依次为74.2%、58.1%、61.3%、77.4%;单体发生率依次为83.9%、83.9%、96.8%、67.7%;纯合性缺失发生率为25.8%、32.3%、22.6%、16.1%。实验组中9p21缺失在肿瘤初发与复发病例之间有显著差异(P=0.041);9p21及7号染色体的多倍体在T1期与T2～4期之间有显著差异(P值分别为0.026及0.038);7号染色体的非整倍体及7、17号染色体的多倍体在G1级与G23级之间有显著差异(P值分别为0.038，0.025及0.047)，9p21的多倍体在G1级与G23级之间有显著差异(P=0.0099)。结论 证实中国人群的膀胱癌尿脱落细胞中存在较高的3、7、9p21及17号染色体变异率，且FISH检测敏感性明显高于细胞学检查。

　　【关键词】 膀胱癌;染色体变异;荧光原位杂交;诊断;监测复发

　　Clinical significance of FISH technique in diagnosis and monitoring the recurrence of bladder cancer

　　MA HongShuang,YAO Cheng,MA KeWei,et al.

　　Department of Rheumatology, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To explore the occurring and development of chromosome abnormality with bladder cancer comparing with that of western people.Methods 32 patients with primary transitional cell carcinoma of bladder or postoperational relapse or clinically highly suspected urology malignant tumor were as experimental group, 20 normal people as control group. The patients in experimental group were studied using FISH technique and cytological examination respectively; those of control group by FISH technique to build up the threshold.Results The sensitivity and specificity of FISH method was respectively 96.8% and 50%; the sensitivity and specificity of cytological examination was respectively 19.4% and 100%. The polyploid rate in turn was 74.2%，58.1%，61.3%，77.4%;monomer rate 83.9%，83.9%，96.8%，67.7%; homozygosity deletion rate 25.8%，32.3%，22.6%，16.1% of chromosome 3, 7, 9 p21 site and 17 in experimental group. There was significant deviation in 9p21 deletion between primary cancer and relapse(P=0.041); in chromosome 9p21 and 7 polyploid between T1 and T2～4 (P=0.026,P=0.038);in chromosome 7 aneuploid and chromosome 7, 17 polyploid between G1 and G2～3 (P=0.038，P=0.025, P=0.047);in chromosome 9p21 polyploid between G1 and G2～3 (P=0.009 9). Conclusions The uric exfoliated cells of bladder and urinary tract epithelial cell carcinoma have higher aberration rate on chromosome 3, 7, 9 p21 site and 17. The sensitivity of FISH technique is obviously better than cytological examination′s.

　　【Key words】 Bladder cancer; Chromosome mutation; Fluorescence in situ hybridization; Diagnosis; Monitoring recurrence

　　目前，膀胱癌患者的监测随访主要依靠膀胱镜及尿脱落细胞学检查，但膀胱镜检查为有创伤性检查，且对于肉眼见不到的肿瘤，应用膀胱镜检查诊断也存在困难〔1〕;尿脱落细胞学检查虽说特异性较高，但对膀胱癌尤其是分级较低的肿瘤诊断敏感性较低 〔2〕。尿脱落细胞荧光原位杂交(FISH)技术代替膀胱镜及细胞学检查，是临床应用诊断及监测膀胱癌复发较为理想的手段。本文旨在中国人群中进行细胞形态学与FISH技术的对比研究，从而探索中国人群中3、7、17及9号染色体p16位点异常与膀胱癌发生、发展的关系，建立符合中国人群特点的膀胱癌分子细胞遗传学资料。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　包括初发膀胱移行细胞癌、膀胱移行细胞癌术后复发癌及临床上高度怀疑泌尿系恶性肿瘤共32例为实验组，其中男22例，女 10 例，男女比例约为2∶1，年龄41～83岁。所有病例均无临床资料和病理诊断结果时，列为盲法设计实验组，对患者尿脱落细胞进行FISH检测，同时进行细胞学检查。实验组全部进行FISH检测及细胞学检查，后经病理结果证实(膀胱良性肿瘤1例，未列入统计)。对照组为正常人20例，男13例，女7例，男女比例约为2∶1，年龄45～76岁;行FISH检测，计算阈值。

　　1.2 方法

　　收集晨尿离心后，用PBS缓冲液冲洗并离心，加入胶原酶B溶液于37℃水浴20 min，离心后加入37℃预热的0.075 mol/L KCl溶液，37℃低渗30 min并离心，加入固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1)于试管中固定10 min，重复3次，然后离心，滴片。待玻片自然干燥后于56℃环境中老化30 min后置于37℃ 2×SSC溶液中10 min。后于37℃胃蛋白酶溶液中消化10 min，室温下于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。将玻片依次置于70%、85%、100%乙醇中各3 min脱水。玻片自然干燥后，56℃烤片至少3 min。然后，将配制完毕的探针加入到微量离心管中混匀，离心后置于73℃水浴箱中变性5 min，再将其置于45～50℃水浴箱中，备用。将滴片后的玻片在变性液中变性5 min，后快速置于-20℃的70%、85%和100%乙醇中各3 min梯度脱水，自然干燥后，于45～50℃烤片机上预热2～5 min。将变性后的探针滴于玻片杂交区域，于预热的湿盒中42℃过夜杂交。次日从湿盒中拿出玻片，于46℃50%甲酰胺 / 2 ×SSC溶液中洗涤3次，每次5 min。后分别于46℃ 2×SSC溶液及2×SSC/0.1% NP40溶液中，漂洗5～10 min，脱水后暗处干燥。加DAPI复染剂于杂交区域，暗处放置10 min，于荧光显微镜下观察，记录结果。

　　1.3 阈值建立

　　对照组尿液脱落细胞行FISH检测，选择信号清晰可辨的细胞进行计数。每一个样本每种探针组合观察100个细胞，统计出不同类型异常情况细胞数目的百分比，计算出阈值(x±3s)。

　　2 结果

　　2.1 对照组各染色体变异阈值

　　见表1。表1 对照组各染色体变异阈值(略)

　　2.2 FISH检测及细胞学检查的敏感性及特异性对比 FISH 检测32例中阳性31例(假阳性1例)，阴性1例(假阴性1例);其敏感度为96.8%，特异度为50%。细胞学检查32例中阳性6例(假阳性0例)，阴性26例(假阴性25例);其敏感度为19.4%，特异度为100%。

　　2.3 各染色体变异率

　　与对照组相比，实验组各染色体及区带的畸变率均明显增高，3、7、9p21及17号染色体多倍体发生率依次为74.2%、58.1%、61.3%、77.4%;单倍体发生率依次为83.9%、83.9%、96.8%、67.7%;纯合性缺失发生率为25.8%、32.3%、22.6%、16.1%。

　　2.4 各染色体变异与性别、年龄的关系 实验组31例尿路上皮细胞癌中，3、7、9p21、17号染色体的畸变与患者的性别及年龄均无显著相关性(P>0.05)。

　　2.5 各染色体变异与肿瘤单发、多发的关系

　　实验组31例尿路上皮细胞癌中，癌性病灶单发病例24例，多发病例7例。3、7、9p21、17号染色体的畸变在肿瘤单发与多发病例之间统计学分析无显著相关性(P>0.05)。

　　2.6 各染色体变异与肿瘤初发、复发的关系

　　实验组31例尿路上皮细胞癌中，初发病例25例,复发病例6例。3、7、17号染色体的畸变在肿瘤初发与复发病例之间的统计学分析无显著相关性(P>0.05);而9p21的缺失在肿瘤初发与复发病例之间的统计学分析有差异(P=0.041)。复发较初发病例具较高的9p21的缺失率。

　　2.7 各染色体变异与肿瘤分期的关系

　　实验组31例尿路上皮细胞癌中，T1期病例18例，T2～4期病例13例。3、17号染色体的畸变在T1期与T2～4期之间的统计学分析无显著相关性(P>0.05);而9p21及7号染色体的多倍体在T1期与T2～4期之间的统计学分析有差异(P值分别为0.026及0.038)。随级别升高，多倍体比率亦随之升高。

　　2.8 各染色体变异与肿瘤分级的关系

　　实验组31例尿路上皮细胞癌中，G1级病例18例，G2～3级病例13例。3号染色体的畸变在G1级与G2～3级之间的统计学分析无显著相关性(P>0.05);7号染色体的非整倍体在G1级与G2～3级之间的统计学分析有差异(P=0.038)。同时，7、17号染色体的多倍体在G1级与G2～3级之间的统计学分析有差异(P值分别为0.025及0.047)，而9p21的多倍体在G1级与G2～3级之间的统计学分析有显著性差异(P=0.009 9)。随级别升高，非整倍体比率亦随之升高。

　　3 讨论

　　3.1 各染色体变异初发、复发的关系 本实验中，9p21的缺失在肿瘤病灶初发与复发病例之间有统计学差异(P<0.05)，表明9号染色体的缺失对膀胱癌的复发有预测作用。因此考虑它有可能成为膀胱癌监测复发的重要分子标志物。以往曾有类似的文献报道指出9号染色体的缺失与复发密切相关〔3〕。更有报道称，9p21的缺失是肿瘤复发的独立预测因素〔4〕。本实验结果与文献报道的结果相一致。但由于我们样本中有些病例随访时间较短，尚不能明确是否复发，或为原发病灶未完全清除所致，所以9p21的缺失与复发和进展之间的相关性还不能明确判定，需继续跟踪随访。

　　3.2 各染色体变异与肿瘤分期的关系

　　对于9p21及7号染色体，高分期的肿瘤较低分期的肿瘤具有更高的染色体变异数目。9p21及7号染色体的多倍体在T1期与T2～4之间有显著差异(P<0.05),T2～4期肿瘤的多倍体明显增加，说明染色体及相关基因的变异，尤其是多倍体可能是促进膀胱癌发生发展的重要因素之一，与膀胱癌的浸润性密切相关。因此，考虑它们有可能成为膀胱癌早期诊断及判断预后的重要分子标志物。以往曾有较多文献指出染色体及相关基因多倍体与膀胱癌分期密切相关，即分期越高，多倍体发生率亦越高〔5〕。

　　3.3 各染色体变异与肿瘤分级的关系

　　实验组病例中，除3号染色体外，高级别的肿瘤均较低级别的肿瘤具有更高的染色体变异数目。7、9p21、17号染色体的多倍体在G1级与G2～3级两组之间存在统计学差异(P<0.05)，随着分级升高，多倍体发生率随之亦显著增高，表明染色体及相关基因的变异，尤其是多倍体与肿瘤恶性程度密切相关，说明其有可能成为膀胱癌判断预后的一项重要分子标志物。以往亦有类似的文献报道，考虑染色体及相关基因的多倍体与膀胱癌的分级密切相关，即分级越高，染色体多倍体发生率亦随之显著增高〔6〕。

　　3.4 FISH技术用于膀胱癌诊断的可行性及有效性

　　遗传学研究表明，肿瘤组织常有特征性的染色体结构及数目的变异，故其可作为膀胱癌的诊断标志。针对于膀胱癌，染色体变异常发生在3、4、7、8、9、11、13、14、17号及Y染色体上，特异性的染色体变异尚未完全确定，所以认为应用单一的染色体畸变诊断膀胱癌可行性不大。Sokolova等从以上这些染色体及基因中筛选出3、7、17号染色体及9p21区带的畸变为膀胱癌的主要诊断标志〔7〕。而且FISH检测降低了膀胱癌因炎症、血尿等情况易出现假阳性的情况〔8〕。所以，美国FDA已经正式批准其上市，用于可疑膀胱癌的血尿患者的诊断及膀胱癌术后需要随访的患者的复发监测等。

　　对于膀胱癌诊断的标准，国内外尚无统一的阳性判断标准，目前的诊断标准较适合于西方国家，而符合中国人群特点的膀胱癌诊断标准，报道较少，所以本实验建立了正常人阈值，为恶性疾病的诊断提供了参照，但因无此方面文献报道，尚需大量正常人及其他泌尿系良性疾病作为广泛对照，才能建立更为详尽的数据资料，为临床早期诊断膀胱癌及监测膀胱癌的预后提供更有力的理论依据。

　　对于膀胱癌的诊断，本实验FISH检测的敏感性与国外报道相符，特异性相对低〔6〕。考虑假阴性率高原因与本组实验样本例数相对较少有关，其特异性与膀胱癌的病理类型，恶性程度等都有所关联，因时间关系，入组标准未做病理类型分析，根据实验设计要求，未做亚组分析。另外，由于本研究仅选择了3个染色体着丝粒及1个特定基因位点探针，需进一步研究其他染色体在膀胱尿路上皮细胞癌及其他尿路疾病患者和正常人尿脱落细胞中的变异情况，为临床诊断及监测提供理论依据。

　　【参考文献】

　　1 Raitanen MP,Kaasinen E,Lukkarinen O,et al.Analysis of false positive BTA STAT test results in patients followed up for bladder cancer〔J〕. Urology,2001;57(4):6804.

　　2 Inoue T,Nasu Y,Tsushima T,et al.Chromosomal numerical aberrations of exfoliated cells in the urine detected by fluorescence in situ hybridization:clinical implication for the detection of bladder cancer〔J〕.Urol Res,2000;28(1)：576

　　1.

　　3 Kruger S，Mess F，Bohle A,et al.Numerical aberrations of chromosome 17 and the 9p21 locus are independent predictors of tumor recurrence in noninvasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder〔J〕.Int J Oncol，2003;23：418.

　　4 Kipp BR，Karnes RJ，Brankley SM,et al.Monitoring intravesical therapy for superficial bladder cancer using luorescence in situ hybridization〔J〕. J

　　Urol，2005;173：4014.

　　5 Vanni R，Scarpa RM，Nieddu M,et al.Cytogenetic investigation on 30 bladder carcinomas〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,1988;30(1)：3542.

　　6 Panani AD，Babanaraki A，Malianga E,et al.Numerical aberrations of chromosomes 9 and 11 detected by FISH in Greek bladder cancer patients〔J〕.Anticancer Res，2004;24(6):385761.

　　7 Sokolova IA，Halling KC，Jenkins RB,et al.The development of a multitarget，multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine〔J〕.J Mol Diagn,2000;2：116 23.

　　8 Halling KC，King W，Sokolova IA,et al.A comparison of BTA stat，hemoglobin dipstick，telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in urine〔J〕.J Urol,2002;167: 20016.