非糖基化尿激酶原突变体的研究

作者:杨波,李天德,王广义,陈练

作者单位：1解放军总医院心内科 北京市 100853；2西藏军区总医院心内科，西藏 拉萨市 850007         【摘要】  　　目的：构建一种非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体，在CHO-dhfr-（二氢叶酸还原酶缺陷型-中国仓鼠卵巢）细胞中表达，收取无血清培养上清，并鉴定其活性。方法：使用PCR扩增的方法，将302位天冬酰胺（Asn302）突变为丙氨酸（Ala302），去掉糖基化位点；将156位精氨酸（Arg156）突变为赖氨酸（Lys156），去掉凝血酶作用位点。将突变体基因转染到CHO-dhfr-细胞中。收取无血清培养上清，并用纤维蛋白板溶解圈法鉴定活性。结果：PCR产物经琼脂糖电泳鉴定分子量略大于1 200道尔顿(dalton)，与理论分子量1 296道尔顿符合。转染成功的细胞株用于扩大培养。纤维蛋白板溶解圈法测定上清活性为29558 IU/ml。结论：非糖基化、抗凝血酶的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂突变体构建成功。转染后细胞生长良好，表达水平较高。

   【关键词】  尿纤溶酶原激活物；凝血酶；糖基化

　　Study for an non|glycosylated pro|urokinase mutant construct/YANG Bo,LI Tian|de,WANG Guang|yi,CHEN Lian//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（2）:

    Abstract：Objective:To construct non|glycosylated,thrombin resistant pro|urokinase mutantTo express pro-UK gene in CHO-dhfr cellsSerum|free culture supernatant was harvestedTo identify the activity of pro-UK mutantMethods:With PCR amplification,glycosylation site was deleted by Asn302-Ala302 mutagenesisThrombin cleavage site was eliminated by Arg156-Lys 156 mutagenesisPro-UK gene was introduced into DHFR-deficient (dihydrofolate reductase,DHFR) CHO cellsSerum|free supernatant was collectedFibrinolytic agarose plate assay (FAPA) was used to identify the activity.Results:DNA molecular weight of PCR product was a little above 1200 daltons as determined by agarose gel electrophoresis,which was consistent with theoretical molecular weight 1296 daltonsThe successfully transfected clone was selected for amplification productionThe fibrinolytic activity of supernatant was 29558IU/ml by FAPAConclusion:Non|glycosylated,thrombin resistant pro-UK mutant was constructedThe cells glowed well after transfectionThe expression is comparatively high.

    Author′s　address：Department of Cardiology,PLA General Hospital,Beijing,100853,China

    Key words：Urine plasminogen activator;Thrombin;Glycosylation 心肌梗塞、脑栓塞及其它血栓病是严重危害人类健康的常见病，我国每年至少有500万人需要溶栓治疗[1]，因此研制高效、特异、副作用小的新型溶栓制剂在心血管疾病的治疗中十分重要，溶栓是否有效，副作用是否最小，对患者的康复有直接影响。尿激酶原（pro-UK）具有选择性溶血栓作用，引起了人们很大的兴趣。本研究构建了一种非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体，通过基因水平的改建，旨在提高尿激酶原活性，降低临床用药的副作用。

    1 资料与方法

    11 一般资料

    111 基因、质粒、菌株、细胞株：pro-UK原基因由本室保存；Ecoli菌株DH5α购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；克隆载体pUC19购自TAKARA生物工程有限公司，高效真核双表达载体pIRES购自clontech公司；CHO-dhfr-细胞由本室保存。

    112 试剂和试剂盒：Pyrobest聚合酶、T4 DNA连接酶购自 TAKARA生物公司；限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ、NheⅠ1、XhoⅠ购自Biolab公司；质粒提取、PCR产物回收、酶切产物回收分别采用 Promega公司 Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、Wizard PCR preps DNA Purification System和 Wizard DNA Clean-up System；寡核苷酸片段合成及序列测定由 Bioasia公司完成。

    113 仪器设备：Model 1000／500型电泳电源及DNA电泳槽为Bio-Rad公司产品；PE9600型PCR扩增仪为Biometra公司产品；4K10型高速冷冻离心机为SIGMA公司产品；CERTOMAT恒温摇床和THERMOMIX恒温浴槽为 BBRAUN公司产品；CO2温箱为美国Forma Scientific公司产品；SVE-4A1型超净台为新加坡ESCO STREAMLINE公司产品。

    12 方法

    121 引物设计引物1：5′-TGCTCTAGAGCGCCACCATGAGACCTGCTGGCGCGCCTCTTCTCTGCGTCCTGG-3′；引物2：5′-GCCTTTGGAGTCGCCCGACCAGGACGAGAGAAGCAGG-3′；引物3：5′-TCGTGAGCGACTCCAAAGGCAGCAATGATCATCAAGTTCC-3′；引物4：5′-CAATAATCTTAAACTTGGGCCTCAGAG-3′；引物5：5′-CTCTGAGGCCCAAGTTAATTATTG-3′；引物6：5′-ATAGTCGGTAGAAGCCTCT| TTCAA-3′；引物7：5′-TTTGGAAAAGAGGCTTCTACCGAT-3′；引物8：5′-CTAAAGCTTCTCGAGTCAGA| GGGCCAGGCCATCTTC-3′。

    122 PCR步骤：第一步：引物 1与引物 2重叠延伸，生成信号肽，并插入 Xba Ⅰ、NheⅠ酶切位点；第二步：引物3与引物4以原基因质粒为模板，得到片段3-4，引入信号肽；引物5与引物6以原基因质粒为模板，得到片段5-6，改构156凝血酶位点；引物7与引物8以原基因质粒为模板，得到片段7-8，改构302糖基化位点，并插入 HindⅢ、XhoⅠ酶切位点；第三步:片段1-2（信号肽）与片段3-4互为模板，重叠延伸得到片段1-4；片段5-6与片段7-8互为模板，得到片段5-8；第四步：片段1-4与片段5-8互为模板，重叠延伸得到1-8全长；第五步：以上次PCR产物（1-8全长）为模板，加入两头引物（引物1和引物8），PCR扩增；低溶点回收PCR产物，得到pro-UK突变体。

    123 基因测序：PCR反应后，将突变体基因与pUC19质粒载体连接，将连接产物完全转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，测定DNA序列。

124 突变体与pIRES双表达载体连接并转化：测序正确的pro-UK/pUC19用Nhe Ⅰ、xhoⅠ双酶切，pIRES双表达载体也用NheⅠ、XhoⅠ双酶切，之后将pro-UK突变体与pIRES双表达载体连接。将连接成功的pro-UK/pIRES产物完全转化DH5α感受态细胞，扩大培养后提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。分子量相符说明pro-UK突变体与pIRES双表达载体连接、转化成功，可用来转染。

    125 脂质体介导重组质粒转染CHO细胞：CHO-dhfr-细胞株培养于含5％小牛血清和1％HT的DF培养液中，转染前一天传代在24孔板，次日细胞铺满率在90％以上。采用阳离子脂质体转染CHO-dhfr-细胞。

    126 活性测定：转染后的细胞逐步扩大培养，待细胞生长铺满100 ml培养瓶，收取24 h无血清培养上清，以纤维蛋白板溶解圈法测尿激酶原活性。

    2 结 果

    21 pro-UK/pUC19酶切鉴定 pro-UK突变体与pUC19克隆载体连接、转化后，经蓝白斑筛选，挑取平板生长的 4个阳性菌落，摇菌过夜，提质粒，用HindⅢ、XbaⅠ双酶切，电泳鉴定，分子量相符的送测序。如图1所示，1-4是菌落，puc19是空质粒（对照），为菌落3号测序结果。

    22 测序结果见图2。

    23 pro-UK/pIRES双酶切鉴定将pro-UK突变体与pIRES双表达载体连接，将连接成功的pro-UK／plRES产物完全转化DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，挑取8个菌落扩大培养，提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。分子量相符说明 pro-UK突变体与pIRES双表达载体连接、转化成功，可用来转染。如图3，菌落1及4-8分子量鉴定正确，可用于转染。

    24 细胞生长状态见图4、图5。

    图1 pro-UK/pUC19酶切鉴定图2 pro-UK突变体测序结果

    图3 pro-UK/pIRES双酶切鉴定图4 转染后的CHO细胞株

    25 纤维蛋白板溶解圈法测尿激酶原活性按文献方法制作纤维蛋白琼脂板，并测定培养上清活性[2]，见表1，图6。表1 尿激酶（UK）标准品活性、UK活性的自然对数及其溶圈直径图6 UK标准曲线 如图6所示，UK标准曲线的公式为y＝03047x-15442，其中y是活性的自然对数，x是溶圈直径（mm），相关系数=1说明该公式线性相关性很好。根据此公式可计算样品的活性，最后再乘以稀释倍数。计算表明，上清液活性为29558 IU／ml。无血清培养的上清液表达水平比较见表2。  表2 无血清培养的上清液表达水平比较

3 讨 论

　1973年Bernik首先在组织培养液中发现了尿激酶原，1981年Wun等证明它是尿激酶的前体，所以称它为尿激酶原（pro|urokinase，pro-UK）。1985年国际血栓形成和止血委员会正式称该酶为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single|chain urokinase|type plasminogen activator，scu-PA）[3]。Pro-UK由411个氨基酸组成，是一种分子量为54KDa的糖蛋白。pro-UK分子中有2个重要的酶切位点，第一位点在 Lys158-Ile159间，该肽链可被纤溶酶水解，pro-UK就被转变为具有高催化活性的双链尿激酶（UK）；第二个酶切位点在Arg156-Phe157间，该肽键可被凝血酶水解，产生分子量为54KDa由二硫键相连的双链分子，但其活性只有双链尿激酶活性的1/500，对人工合成的底物及纤溶酶原几乎没有酶学活性[4]。在临床应用中，我们希望 pro-UK在 Lys158-Ile159间断链，产生高催化活性的物质，以期达到溶栓作用，而不希望在Arg156-Phe157间断链，因后者活性极低，几乎没有溶栓作用。因此本实验将天然尿激酶原基因改构，去掉Arg156-Phe157作用位点，使之在临床用药过程中，不产生无活性的物质。pro-UK分子糖基化位点Asn302上的寡糖链可影响pro-UK在血液中的半衰期和活性。pro-UK在体内主要受肝细胞膜上的特异性受体所介导，并在肝细胞溶酶体中被降解，血中半衰期约为8 min。人们将天然的或由哺乳动物细胞表达的pro-UK，pro-UK突变体和大肠杆菌表达的pro-UK进行比较，发现糖基化的和非糖基化的pro-UK对纤维蛋白的溶解都是有选择性的、血栓特异性的。非糖基化的pro-UK被纤溶酶活化的能力比糖基化pro-UK强，其催化活性也比糖基化pro-UK强[5]，但非糖基化的 pro-UK对纤溶酶活化敏感，也导致了非糖基化pro-UK比糖基化pro-UK在血浆中更不稳定[6]。因天然pro-UK基因是糖基化的，导致人们对非糖基化pro-UK的性质知之甚少，故本研究构建了一种非糖基化pro-UK突变体，以便进一步研究其性质，并与天然pro-UK比较。本研究采用PCR扩增的方法，达到上述构建基因突变体的目的，经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定表明突变体分量与预知的非糖基化pro-UK分子量符合，基因序列测定证实该突变体的氨基酸序列与实验设计相符。转染后细胞生长良好，在未经MTX加压（提高CHO细胞表达的一种方法）的情况下，表达水平即可达到29558IU/ml·24h，相当于3 μg/106细胞·24h，与本实验室保存的天然pro-UK细胞株表达水平接近，而后者是本实验室经过2年反复MTX加压、筛选表达水平更高的单克隆细胞株的最终成果。因此，本实验初步研究表明，非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体构建成功，表达活性满意。该突变体性质的深入研究及其对尿激酶原生产、临床用药的影响正在进行中。

【参考文献】  　　[1]杨 波，李天德，胡显文急性心肌梗死的静脉溶栓治疗［J］.生物技术通讯，2005，16（1）：100-104.

[2]叶建新，肖成祖，张正光重组尿激酶原的纯化和性质研究［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23（1）：63-65.

[3]Gurewich V.Pro|urokinase:history,mechanisms of action,and clinical development//New therapeutic agents in thrombosis and thrombolysis(Loscalzo J,Saashara AA,editors)［J］.New York:Marcel Dekker，1997:495-511.

[4]Gurewich VThrombolytic agents［J］.N Engl J Med，1994，330(4):291-296.

[5]Lenich C,Pannell R,Henkin J,et alThe influence of glycosylation on the catalytic and fibrinolytic properties of pro-urokinase［J］.Thromb Haemost，1992，68(5):539-544.

[6]Spraggon G,Phillips C,Nowak UK,et alThe crystal strucre of the catalytic domain of human urokinase|type plasminogen activator［J］.Structure，1995，3(7):681-691.