卡维地洛对缺氧、再供氧心肌细胞缝隙连接通道蛋白43表达的影响

作者:曾玉杰,冯义柏 

作者单位：中日友好医院心内科，北京市 100029        【摘要】  目的：检测卡维地洛(Cavedilol，CVD)对缺氧再供氧时心肌细胞缝隙连接通道蛋白43（Conexin 43,CX43）的基因表达和CX43通道蛋白变化的影响。方法：原代培养心肌细胞，随机分为2组：未用药组，CVD组。建立缺氧、再供氧模型，分别于正常、缺氧30 min、再供氧1 h、2 h、3 h、6 h搜集细胞。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CX43mRNA表达、蛋白免役印迹法（Western blot）检测CX43蛋白的含量。结果：未用药组的心肌细胞缺氧30 min时CX43mRNA表达与蛋白含量和正常相比无显著差异（P>005）。再供氧1 h、2 h、3 h、6 h则分别减少了3916%、4500%、4667%、5167%，和正常时相比差异显著（P<001）。其中再供氧1 h下降幅度最大。用CVD干预后再供氧1 h、2 h、3 h、6 h则分别减少了2295%、2787%、3033%、3525%（P<001）。再供氧1 h、6 h的下降幅较未用药组分别减少了4139%、3178%，差异显著（P<001）。结论：心肌细胞缺氧再供氧时，其CX43基因表达和蛋白含量明显减少， 卡维地洛可抑制CX43降解。

   【关键词】  卡维地洛 缝隙连接通道蛋白43 卡维地洛 心肌再灌注

    Cavedilol influence on CX43 expression in myocardial cells with oxygen defect and resupply/ZENG Yu|jie,FENG Yi|bai,YU Shi|long,ZHU Dan|dan,LI Zhi|yuan,LI Nan,JIANG Lei,WANG Yong,KE Yuan|nan//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（3）：266

    Abstract：Objective:To investigate the effects of carvedilol （CVD）on expression of conexin43（CX43） gene and CX43 protein in myocardial cells with oxygen defect and resupply.Methods:A culture system of neonatal cardiac myocytes and the model of the myocardial cells with oxygen defect and resupply were established.The cultured myocytes were randomly divided into two groups: control group(without CVD treated), CVD group.The cells were collected at normal,oxygen defect for 30min,and oxygen resupply for 1h,2h,3h and 6hThe CX43 mRNA level of cells was determined with reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR).The content of protein was detected by western blotting.Results:In control group, there were no significantly different of CX43 expression between normal and myocardial cells oxygen defect for 30 min (P>005).The CX43 depression decreased 3916%、4500%、4667%、5167% in myocardial cells oxygen resupply for 1h,2h,3h and 6h(P<001).In CVD group, comparing with normal， the expression of CX43 decreased by 2295%、2787%、3033%、3525% in oxygen resupply for 1h,2h,3h and 6h（P<001）.The expression of CX43 of CVD group increased 4139% and 3916% in oxygen resupply for 1h and 6h,compared with control group(P<001）.Conclusion:The CX43 mRNA level of cells and the content of CX43 protein significantly decrease during myocardial cells oxygen resupply. The degradation of CX43 is inhibited by carvedilol.

    Author′s　address：Department of Cardiology, China|Japan Friendship Hospital;Beijing,100029,China

    Key words：Carvedilol;Conexin43;Myocardium reperfusion 细胞缝隙连接（gap junction,GJ）是一个低阻力电通道，在细胞间进行着小分子物质和离子的直接交换，使心脏进行同步收缩完成心脏泵功能。GJ通道是由十几种缝隙连接通道蛋白（Conexin,CX）构成的，其中缝隙连接通道蛋白43（Conexin43,CX43）是心室肌细胞含量最多一种，其数量对心肌的电机械活动有着重要的影响［1］本研究将在培养的心肌细胞缺氧、再供氧模型上研究CX43的表达数量及卡维地洛(Cavedilol，CVD)对其的干预作用。

    1 资料与方法

    11 原代心肌细胞的培养按Higgins等［2］建立的方法培养心肌细胞，即取生后2~4 d Wistar乳鼠，剪取心室，用025%胰蛋白酶分离心肌细胞，以含10%新生小牛血清的DMEM培养基制备细胞悬液，接种于玻璃培养瓶中，每瓶细胞数为3×106个，置培养瓶于二氧化碳培养箱中，37℃，95%空气+5%CO2，一定湿度条件下培养。每2~3 d更换培养基一次，取培育7 d细胞单层进行实验。

    12 肌细胞缺氧再给氧损伤模型建立无糖Hank's液用高纯氮气饱和30 min，使培养基氧分压低于400 kPa。换用缺糖缺氧培养基后，培养瓶内立即充入氮气1L/ min流量30秒，以驱除瓶内氧气，然后塞紧瓶盖密闭培养，缺氧30 min后换用正常含糖的Hanks液（95%空气+5%CO2）培养1 h、2 h、3 h、6 h，造成再给氧损伤。检测细胞CX43的mRNA表达，并进行CX43蛋白定量检测。

    13 逆转录PCR技术(reverse transcription PCR,RT-PCR)总RNA的抽取: 按Trizol一步法抽提正常、缺氧、再灌注时的心肌细胞RNA。进行总RNA纯度、浓度及RNA完整性的检测，后进行逆转录反应及cDNA合成（RT） 和聚合酶链式反应(PCR)，引物分别为： CX43：5′-CTCAAAGTGGCCCAGACTGAC-3′； 5′-GTGGTAAGGATCGCTTCTTCC-3′。内标β-globin（肌球蛋白）: 5′-CAACTTGATCCACGTTCACC-3′； 5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′。产物片段大小分别为408bp和270bp。经反应和循环，PCR产物留作电泳分析。观察及拍照，用计算机图象分析系统作光密度值测定，并经内参校正，确定CX43基因表达的相对含量。

    14 心肌细胞Western 印迹（blot）检测提取蛋白质，进行样品总蛋白含量测定，制胶，制备蛋白质样品并加样，免疫印迹显色，烤干保存硝酸纤维素滤膜或摄影，图象分析仪测定条带的光密度值（OD），并作定量分析。

    15 给药方案未用药组：心肌细胞缺氧30 min，分别在再供氧1、2、3、6时收取细胞，分别提取RNA和蛋白。另提取正常、缺氧30 min后的心肌细胞RNA和蛋白备用；CVD组：用CVD原粉剂配成1‰的浓度的培养液缺氧前30 min换用。其他同未用药组。

 16 统计学处理数值以均值±标准差(±s)表示，组间以t检验进行统计学处理，P<005为差异有显著性。

    2 结 果

    21 模型及样品鉴定经心肌原代细胞的鉴定确认样品为心肌细胞，提取的RNA经紫外线测定OD260/OD280的比值均在18以上，表明所提取的RNA纯度高，没污染，可用于RT-PCR。细胞总蛋白质经SDS聚丙酰胺凝胶电泳分离后，凝胶用考马斯亮兰染色后（图1）可见各蛋白条带清晰，染色好，表明蛋白没有降解，可用于Western blot检测。

     22 RT-PCR

    221 未用药组：正常心肌细胞CX43mRNA为120±023，缺氧30 min为118±026，再供氧1 h为073±037，2 h为066±012，3 h为064±034，6 h为098±03。6h时与正常心肌细胞相比CX43 mRNA减少了52%,和正常相比差异显著（P<005）见图2。

    图2 未用药组RT-PCR电泳分析CVD组：在再供氧过程中，CVD组不同时间段的CX43mRNA表达也有一定的减少（图3），但减少的程度较未用药组明显减轻，于再供氧6 h时进行比较，两者CX43mRNA含量有显著性差异（P<005）。它们的减少的趋势如图4。

    23 Western blot 检查结果在硝酸纤维膜上用CX43抗体标记显色，约43kD大小的分子显色，各个泳道的43kD的显色带反映了CX43的含量多少。计算机扫描分析各组的每个时间点蛋白的平均含量，如表1所示，再供氧6 h时，CVD组CX43蛋白减少程度较未用药组轻（P<001）。注：与未用药组相比△△P<001。表1 不同时间点各个组CX43蛋白含量的OD值(

　　3 讨 论

　　CX基因表达的改变、新的GJ通道的合成和已有的通道的降解对心脏的各种功能有重要的影响［3］。 Saffitz研究发现，CX43的多肽蛋白的半衰期在13 h，溶酶体、蛋白酶体参与了CX43的降解［4］。随着缺血再灌注时间延长，蛋白酶释放增多，可能是CX43急剧减少的原因之一。 Fernandez-Cobo等［5］通过对肝脏进行缺血再灌注1 h后Western 印迹检测发现CX43蛋白明显减少。在给大鼠运用了细菌提取的脂多糖后，心肌也有类似的CX43蛋白减少，这实验说明CX43的表达和炎症反应有关。进一步研究发现，肿瘤坏死因子（TNF-a）因子可以减少CX43基因的激动子的活性，从而使CX43基因表达减少。在缺血再灌注心脏中TNF-a等细胞因子表达明显增多，因此，TNF-a也可能是缺血再灌注CX43急剧减少的原因之一［6］。在用CVD干预后，CVD组再供氧时CX43 mRNA表达及CX43蛋白下降程度较未用药组减轻明显（P<001）。关于对CX43降解的影响可能与CVD的以下几个方面有关：首先是CVD的β受体拮抗作用，使心肌细胞的起搏频率减慢，心肌细胞的耗氧量减少，增加了对缺氧的耐受性；β受体的拮抗使cAMP减少，相应地使GJ的通透性下降，Ca2+传递减慢，心肌细胞受损减轻。β受体的拮抗还可以使心肌代谢由脂肪酸转向葡萄糖，进一步降低氧耗。其二，CVD强力的抗氧化作用可拮抗心肌缺氧产生的氧自由基所致的损害［7］。其三，CVD的抗炎作用：现已知中性粒细胞在缺血再灌注心肌浸润和梗塞范围相关，在再灌注后，氧自由基、细胞因子以及其他炎症调节因子释放促使中性粒细胞浸润导致心肌损伤。CVD明显减少中性粒细胞在缺血再灌注损伤心肌上的聚集。CVD可以通过抑制一个关键的细胞内粘附分子的表达（细胞粘附分子-1，ICAM-1），从而抑制中性粒细胞粘附到内皮细胞上，达到限制中性粒细胞引起的组织损伤［8］。本研究表明CX43表达减少主要和缺氧再供氧中诱发的急性炎症有关，通过相应的干预性治疗，可以有效地减轻CX43的降解，以达到减轻心肌损伤的作用，为今后相关的治疗提供了方向。

【参考文献】  [1]Danik SB, Liu F, Zhang J, et al. Modulation of cardiac gap junction expression and arrhythmic susceptibility［J］.Circ Res，2004，95(10):1035-1041.

[2]Higgins TJC,Bailey P J,Allsopp DCultured rat myocytes as a model for the study of myocardial ischaemic necrosis［J］.J Pharm Pharmacol，1981,33(8-12):644.

[3]Dank SB,Liu F,Zhang J,et al.Modulation of cardiac gap junetion expression and arrhythmic susceptibility［J］.Circ Res，2004,95(10):1035-1041.

[4]Saffitz JE, Laing JG, Yamada KA，et alConnexin expression and turnover: implications for cardiac excitability［J］.Circ Res，2000，86(7):723-728.

[5]Lin LC, Wu CC, Yeh HI,et al.Downregulated myocardial connexin 43 and suppressed contractility in rabbits subjected to a cholesterol|enriched diet［J］.Lab Invest，2005,85(10):1224-1237.

[6]Petrich BG, Gong X, Lerner DL,et alC-Jun N-terminal kinase activation mediates downregulation of connexin43 in cardiomyocytes［J］.Circ Res，2002，91(7):640-647.

[7]El-Demerdash EEvidences for prevention of nitroglycerin tolerance by carvedilol［J］.Pharmacol Res，2006，53(4):380.

[8]Jordan JE, Zhao ZQ, Vinten|Johansen JThe role of neutrophils in myocardial ischemia|reperfusion injury［J］.Cardiovasc Res，1999，43(4):860-878.