贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾组织MCP1表达的影响

　　作者：赵吉光 许钟镐 崔文鹏 赵石磊 周文华 苗里宁 作者单位：吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 观察单核细胞趋化蛋白1(MCP1)在早期糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织的表达、尿中的排泄情况及贝那普利的干预效果。方法 成年雄性Wistar大鼠分为对照组(NC)、DN模型组(DN)和DN+治疗组(DN+贝那普利)。DN+贝那普利组给予贝那普利灌胃，NC和DN组以等量蒸馏水灌胃。饲养4 w后观察大鼠生理生化指标的变化、尿中的MCP1在排泄量、肾脏组织病理学变化及肾脏组织中MCP1的表达水平。将第5代培养的肾小球系膜细胞分为对照组(NC)、高糖组(HG)和高糖+治疗组(HG+贝那普利)，观察系膜细胞内MCP1 mRNA表达。结果 DN组和DN+贝那普利组大鼠血糖较NC组显著升高(P<0.01)。 DN组大鼠肾重、肾脏肥大指数、尿白蛋白(UAlb)/尿肌酐(Ucr)、尿MCP1/Ucr及肾组织内MCP1的水平均明显高于NC组;与DN组比较，上述指标在DN+贝那普利组明显下降，差异有统计学意义。肾脏病理显示DN组病理改变较DN+贝那普利组重。细胞实验显示，HG组所培养的系膜细胞内MCP1 mRNA表达水平显著高于NC组，但用贝那普利处理后MCP1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。结论 MCP1在早期DN大鼠肾组织中的表达及尿中的排泄均增加，MCP1的监测有望成为早期DN的预测指标。

　　【关键词】 糖尿病肾病 MCP 1 贝那普利

　　Effect of benazepril on the renal MCP1 expression in the diabetic nephropathy rats

　　ZHAO JiGuang，XU ZhongGao，CUI WenPeng，et al.

　　Department of Nephrology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041,Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To investigate monocyte chemoattractant protein (MCP)1 expression in kidney tissue and excretion in urine of early diabetic nephropathy (DN) rats and the effect of angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEI) benazepril on DN. Methods Adult male Wistar rats were divided into normal control (distilled water intragastric administration), DN (distilled water intragastric administration), benazepril (ACEI) groups (benazepril intragastric administration).Physiological changes, urinary MCP1 excretion, histological changes of kidney tissue and MCP1 expression of kidney tissue were observed 4 w later. The cultured fifth generation mesangial cells were devided into normal control, high glucose (HG), HG + ACEI groups to observe MCP1 expression in mesangial cells by RTPCR. Results After 4 weeks, blood glucose level was significantly higher in DN and DN+ACEI groups than that of normal control group (P<0.01). Kidney weight, kidney hypertrophy index, urinary albumin (UAlb)/urine creatimine (Ucr), urinary MCP1/Ucr and MCP1 level in kidney tissue in DN group were obviously higher than those of normal control group;but the above indexes in DN+ACEI group were all significantly decreased compared with those of DN group. Kidney pathology showed that DN group had more serious changes than DN+ACEI group. Cytological test showed MCP1 mRNA expression level in HG group was significantly higher than that of normal control group, but ACEI treatment significantly decreased upregulated MCP1 expression (P<0.01). Conclusions Early DN rats have increased MCP1 expression in kidney and excretion in urine. ACEI could decrease MCP1 expression. MCP1 might be the predictive marker for monitoring early DN.

　　【Key words】 Diabetic nephropathy;monocyte chemoattractant protein (MCP)1;Benazepril

　　糖尿病早期的肾脏功能损伤主要是微量白蛋白尿的出现，微量白蛋白尿只是糖尿病肾病(DN)的早期临床表现，尚不能作为糖尿病发展为DN的预警指标来用于临床。因此，寻找一个早期诊断DN的有效指标就显得尤为重要。近期的研究发现糖尿病时单核细胞趋化蛋白1(MCP1)在肾脏的表达和尿中的排泄增加，MCP1可以通过趋化单核细胞/巨噬细胞至肾脏，从而介导肾脏炎症。MCP1的增多使肾小球中单核/巨噬细胞浸润,导致细胞外基质在肾小球和肾小管中堆积,从而参与DN的发生、发展〔1～5〕。本实验旨在探讨DN大鼠的早期肾脏改变、尿及肾组织中MCP1的变化及贝那普利的干预作用，为DN的防治提供线索及依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和材料 链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)，兔抗大鼠MCP1抗体(美国Santa Cruz公司)，RNA STAT60试剂(美国TelTest Inc.)，RTPCR试剂盒(美国Applied Biosystems)，Taq DNA聚合酶、oligodT和dNTP (德杭州博日科技有限公司)，引物(上海生工生物工程技术服务有限合成)，D葡萄糖(美国Sigma公司)，免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.2 动物实验 实验动物共分3组。成年雄性Wistar大鼠，适应性饲养1 w，测血糖正常。随机取10只大鼠作为正常对照组(NC，n=10);其余20只大鼠一次性腹腔注射STZ(55 mg/kg，溶于pH4.2，0.1 mol/L枸橼酸枸橼酸钠缓冲液，冰浴新鲜配制)，NC组注射等量的枸橼酸枸橼酸钠缓冲液。48 h后经大鼠尾静脉采血测血糖，NC组血糖正常，其余20只大鼠随机血糖均高于16.7 mmol/L，糖尿病模型成功。将该20只大鼠随机分成两组，即DN模型组(DN，n=10)和DN+贝那普利治疗组(DN+贝那普利，n=10)。DN+贝那普利组给予贝那普利(10 mg/kg)灌胃，NC组、DN组以等量蒸馏水灌胃。观察4 w后大鼠血糖(BG)、体重(BW)、肾重(KW)、肾脏肥大指数(KHI)、尿白蛋白(UAlb)/尿肌酐(Ucr)、尿MCP1/Ucr的变化;并取肾组织观察肾脏组织病理学变化，免疫组化法检测肾脏组织中MCP1的表达水平。

　　1.3 细胞实验 培养的肾小球系膜细胞分3组：正常对照组(NC，5.6 mmol/L D葡萄糖)，高糖组 (HG，30 mmol/L D葡萄糖)，高糖+贝那普利组 (HG+贝那普利，30 mmol/L D葡萄糖+10 μmol/L贝那普利)。120 h后收集细胞。

　　1.4 RTPCR 提取各组细胞总RNA，用逆转录聚合酶链反应方法检测MCP1mRNA表达水平。用RNA STAT60试剂一步法提取总RNA。用RTPCR试剂盒合成cDNA。MCP1上游引物序列为5′CCTGCTGCTACTCATTCAC3′,下游引物序列为5′TCTCACTTGGTTCTGGTCC3′，扩增引物长度191 bp;GAPDH的上游引物序列为5′GACAAGATGGTGAAGGTCGG3′，下游引物序列为5′CATGGACTGTGGTCATGAGC3′，扩增引物长度为538 bp。循环条件：94℃变性 40 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，循环结束后72℃延伸7 min，进行循环37次。最后将各PCR扩增产物在2% 琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)中电泳，于紫外线灯下拍照。为了半定量PCR产物，将胶片上反应条带在图像分析仪中扫描。

　　1.5 免疫组织化学 常规石蜡包埋，切片厚2 μm脱蜡至水;含3% H2O2的甲醇室温孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶;微波修复抗原;加入1∶100稀释的兔抗鼠单克隆抗体，置湿盒中4℃过夜;1∶100稀释生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育25 min;DAB显色：1 ml蒸馏水加入试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间5 min，阳性细胞于细胞胞浆出现棕黄色颗粒;苏木素轻度复染细胞核;脱水、透明、中性树胶封片。光镜观察肾组织细胞内棕褐色颗粒为阳性。每批均设有阴性对照。

　　1.6 统计学处理 数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，两组以上比较采用ANOVA检验。

　　2 结果

　　2.1 动物一般情况分析 实验4 w后，NC组大鼠BW增加迅速，与NC组相比DN组、DN+贝那普利组大鼠增长缓慢，差异有统计学意义(P<0.01)。DN组和DN+贝那普利组大鼠血糖较NC组明显升高，且维持在较高水平上。同期DN组和DN+贝那普利组大鼠之间体重与血糖相近，无显著性差异。DN组肾重明显高于NC组，DN+贝那普利组较DN组明显下降(P<0.01)。DN组肾脏肥大指数明显高于NC组(P<0.01)，DN+贝那普利组则较DN组明显降低(P<0.05)。DN组尿MCP1/Ucr与UAlb/Ucr均较NC组明显升高(P<0.01)，DN+贝那普利组上述各项指标较DN组明显降低 (P<0.01)(见表1)。

　　2.2 病理分析 DN组表现为肾小球体积明显增大，细胞肥大，系膜基质轻度增生，基底膜略增厚等早期DN的病理表现。DN+贝那普利组上述改变较DN组为轻，肾小球体积有所缩小，系膜基质增生不明显(见图1)。

　　表1 各组大鼠生理生化指标的变化(略)

　　与NC比较：1)P<0.01;与DN比较：2)P<0.05，3)P<0.01

　　图1 各组大鼠肾脏组织病理结果(PAS染色，×400)(略)

　　2.3 MCP1在肾小球内的表达 正常对照组有少量MCP1阳性染色。DN组与NC组比较，肾脏MCP1表达明显增加，DN+贝那普利组与DN组比较MCP1阳性染色明显下降(见图2)。

　　图2 各组大鼠肾脏组织中MCP1的表达情况(DAB，×400)(略)

　　A. NC组;B. HG组;C. HG+贝那普利组。

　　图3 系膜细胞MCP1mRNA的RTPCR检测结果(略)

　　2.4 MCP1 mRNA在系膜细胞内的表达 凝胶电泳条带显示，与NC组相比，HG组系膜细胞内MCP1mRNA表达水平明显增高(P<0.01)，贝那普利能抑制HG环境下的MCP1mRNA表达水平的升高，HG+贝那普利组MCP1mRNA的相对表达量明显低于HG组(P<0.01)(见图3，图4)。

　　图4 系膜细胞MCP1mRNA的相对表达量(略)

　　3 讨论

　　近年来许多实验和临床资料均提示DN除了血糖、血脂代谢紊乱、血流动力学异常外，还存在细胞因子、炎症介质水平上升和炎性细胞浸润，越来越多的证据显示炎症在DN的发生发展中起重要作用〔6，7〕。MCP1对单核细胞具有特异的趋化作用〔1〕。MCP1的增多可使肾小球中单核/巨噬细胞浸润，导致细胞外基质的堆积，从而参与DN的发生、发展。MCP1在DN患者中增高的机制可能如下：(1)高血糖和糖基化产物可刺激MCP1mRNA表达〔2〕;(2)DN患者中IL1、TNFα、PDGF、TGFβ等均升高,它们可刺激肾小球内皮细胞、系膜细胞表达高水平的MCP1〔3〕;(3)DN患者出现蛋白尿后可通过升高TGFβ刺激MCP1的分泌〔4〕;(4)DN患者一般都存在血脂代谢紊乱，高低密度脂蛋白(LDL)及其代谢产物氧化修饰的LDL均可刺激MCP1mRNA表达〔5〕;(5)局部的肾素血管紧张素系统(RAS)的产物血管紧张素Ⅱ也可刺激系膜细胞合成MCP1〔8〕。可见与DN发生发展有关的很多因子和MCP1表达有着密切的关系，抑制MCP1的表达可阻止或延缓DN的进展。

　　本实验研究了STZ诱导的Wistar大鼠的早期肾脏改变，尿及肾组织中MCP1的变化及贝那普利贝那普利的干预作用。实验于成模4 w时处死大鼠，行肾脏病理及PAS染色。结果表明，DN组仅表现肾小球体积增大，系膜基质轻度增生，表明处于早期DN。肾脏MCP1免疫组化染色可见DN组较NC组阳性表达明显增多，而用药组肾组织MCP1的表达较模型组明显减少。本实验还测定了各组大鼠尿MCP1，结果显示DN组尿MCP1明显升高，与正常对照组比较，有显著性差异，用药组较模型组则有明显改善。上述结果充分表明在DN的早期，肾组织在系膜基质增生不明显的情况下，已有大量的MCP1表达，表明MCP1参与早期DN的进展。本实验还研究了高糖刺激下系膜细胞MCP1mRNA的表达情况，结果显示高糖刺激的系膜细胞MCP1mRNA水平明显增高，然而贝那普利处理可降低MCP1mRNA的表达。贝那普利在抑制血管紧张素Ⅱ生成的同时，降低了DN大鼠尿中MCP1的含量及白蛋白的生成，减少了肾组织内MCP1的表达，说明高糖通过RAS诱导MCP1的增加，贝那普利对DN的保护作用与抑制MCP1的产生及减少肾小球的炎症浸润有关。

　　本实验结果证实，MCP1在早期DN大鼠肾组织中的表达明显增多，表明其在DN早期诊断中具有重要的意义，监测MCP1在尿中的含量有望作为早期DN发生、发展的预测及早期诊断方法。贝那普利可减少MCP1表达，减轻DN炎症反应，延缓DN的进展。随着人们对MCP1 的认识不断深入，阻断MCP1的治疗方法将有可能应用于防治早期DN。

　　【参考文献】

　　1 Schlondorff D，Nelson PJ，Luckow B,et al.Chemokines and renal disease〔J〕.Kid Int,1997;51:61021.

　　2 Matsui T，Yamagishi S，Ueda S,et al.Telmisartan，an angiotensin Ⅱ type 1 receptor blocker，inhibits advanced glycation endproduct (AGE)induced monocyte chemoatractant protein1 expression in mesangial cells through downregulation of receptor for AGEs via peroxisome proliferatoractivated receptorgamma activation〔J〕.J Int Med Res,2007;35:4829.

　　3 Carla Z，Roberta D，Stella C,et al.Protein overload stimulates RANTES production by proximal tubular cells depending on NFκB activation〔J〕.Kidney Int,1998;53:160815.

　　4 Kamanna VS，Paj R，Roh DD,et al.Oxidative modification of lowdensity lipoprotein enhances the murine mesangial cell cytokines associated with monocyte migration，differentiation，and proliferation〔J〕. J Lab Invest,1996;74:106779.

　　5 Ruizortega M，Bustos C，Hemandezpresa MA，et al.Angiotensin Ⅱ participates in mononuclearcell recruitment in experimental immune complex nephritis through nuclear factorkappa B activation and monocyte chemoattractant protein1 synthesis〔J〕.Immunol,1998;6:4309.

　　6 Chow F，Ozols E，Nikolic Paterson DJ,et al.Macrophages in mouse type 2 diabetic nephropathy correlation with diabetic state and progression renal injury〔J〕.Kidney Int,2004;65:11628.

　　7 Wolf G，Ziyadeh FN.The role of angiotensin II in diabetic nephropathy：emphasis on nonhemodynamic mechanisms〔J〕.Am J Kidney Dis,1997;29：15363.

　　8 Calandra T，Bernhagen J，Metz CN,et al.MIF as a glucocorticoid induced modulator of cytokine production〔J〕.Nature,1995;377:6871.