乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测方法的建立

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)有4个开放读码框架，编码6种蛋白，其中的S基因编码3种外膜蛋白，包括主蛋白(即HBsAg)，中蛋白(即HBsAg和Pre-S2蛋白)和大蛋白(即HBsAg,Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白)。随着人们对乙肝病毒认识的深人，在预防、诊断和治疗方面都有了一定的突破，既往的常规诊断方法(包括乙肝标志物、乙肝核酸的检测)已不能满足临床诊治需求。近年来通过对乙肝病毒外膜大蛋白(hepatitisBviruslargesurfaceprotein,HBV-LP)在乙型肝炎发病机制、感染与病毒复制等方面的探究，逐渐认识到其具有较为重要的临床意义。血清HBV-LP为临床提供了一个新的监测HBV感染者体内病毒复制、疾病进程、抗病毒疗效、肝细胞损伤与预后的血清学敏感指标，尤其适用于血清HBeAg阴性和低水平HBVDNA复制的HBV感染者的监测，能弥补HBVDNA监测的不足，有助于提高HBV感染者的血清学诊断的准确性，对指导临床乙肝的治疗具有一定的应用价值。我们在既往的研究中，获得了HBV-LP的单抗和多抗。因此我们力图建立HBV-LP的ELISA检测方法。对象与方法1.1仪器深圳汇松科技发展有限公司生产的PW-960型洗板机，美国Thermo公司生产的LabsystemsMK3型酶标仪。1.2试剂96孔酶标板购自北京凤翔科技有限公司，辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)购自美国Sigma公司，其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司。HBV-LP及其多抗和单抗为本室保存。1.3方法1.3.1HBV-LP单抗的标记:根据参考文献〔4]，应用改良过碘酸盐氧化法，用HRP对HBV-LP单抗进行标记。1.3.2检测方法的建立:应用双抗体夹心法，将纯化的多抗按常规方法，以碳酸盐缓冲液做不同浓度稀释，包被ELISA板，4℃过夜，取出后洗板3次，再用1%BSA于37℃封闭2h后洗涤。用阴、阳性血清作方阵滴定，于37℃放置1h后洗板，每孔中加人100闪稀释至工作浓度的酶标HBV-LP单抗，370C1h后洗板，再向每孔中加人100闪TMB显色液，37℃反应10min，最后加人2mol/L的HZSO:终止反应，用酶联检测仪测定A45。值，进行结果判定。反应条件及反应液配制，根据参考文献介绍方法进行调整优化而来。1.3.3HBV-LPELISA检测方法的性能评估:按参考文献「5〕所述方法，对检测系统的特异性、精密度、稳定性评估。1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行数据的统计分析2结果2.1HBV-LPELISA各种工作液和反应条件的确立2.1.1包被液及封闭液:选取了1份强阳性和1份弱阳性血清，对不同的包被液和封闭液，进行了比较，见表1。结果显示选择碳酸盐包被液和牛血清白蛋白(BSA)封闭液时，所获得的人/w值较好。因此，选用碳酸盐包被液和BSA封闭液，用于固相抗体的包被及封闭。2.1.2抗体包被血清稀释倍数的选择:采用倍比稀释的方法，对包被多抗和已知阴、阳性血清进行系列稀释后，通过方阵滴定试验，确定最佳稀释倍数，检测结果见表2。在血清及包被抗原的稀释倍数较低时，阳性血清的A值维持在一个较高水平，随着稀释倍数的增加，A值呈下降趋势。酶标仪在A值为1.0左右时误差最小，反应最灵敏。通过表2数据我们可以看出，当多抗包被浓度为25一100}a,g/ml,血清最佳稀释倍数为1:80满足上述条件。考虑到节省包被抗体，最终确定抗体包被最佳浓度为25N.,g/ml，血清稀释倍数为1:80。2.1.3酶标抗体的稀释度:酶标抗体进行系列稀释后，分别对强阳性和弱阳性血清进行检测，计算Asiw，结果显示1:2000时结果最好。2.1.4判断标准的计算:取40份阴性血清用初步建立的ELISA方法进行检测，以40份阴性血清的平均A值加3倍标准方差作为阴阳性的临界值，计算结果为0.252，大于此值为阳性，小于或等于此值为阴性。2.1.5温育条件及时间:分别选择室温(25℃左右)和37℃温育条件，分别在反应的第30,45,60,75,90,105,120min时进行检测。结果分析显示温育温度37℃最好，血清加入后反应60min时效果最好，酶标2抗加人后反应时间为45min最佳。2.2HBV-LPELISA检测方法性能评价2.2.1特异性:选择了甲肝、丙肝、戊肝等患者的阳性血清进行检测，其检测A值均<0.1为阴性，即没有交叉反应。2.2.2精密度:以高、中、低3种不同浓度的质控血清，分10孔平行3次重复测定，计算每次测定值的批内和多次分析的批间变异。结果显示批内变异在6.2%一9.6%之间，批间变异在7.7%一9.9%之间，均<10%。2.2.3稳定性:将所有反应物分别置于4℃和37℃，在3,5,7d时在线性、灵敏度、精密度方面进行检测从而考察其稳定性，同时进行低、中、高值血清的检测计算标准差。结果计算后显示相关系数均>0.96，标准偏差均<10%。3讨论感染了乙型肝炎病毒的细胞可分泌三种病毒颗粒:小球形颗粒、管状颗粒和Dane颗粒，其中管状颗粒和Dane颗粒的外膜结构蛋白组成基本一致，包括主蛋白、中蛋白和大蛋白。HBV-LP具有双重跨膜拓扑结构，由PreSl,PreS2和S结构域组成。这种特殊的构象是HBV-LP发挥多种生物学功能作用的依赖性结构。HBV-LP在病毒进人肝细胞时作为受体蛋白起作用，在病毒组装时，则是基质类似蛋白，同时还行使调节功能。HBV-LP对HBV复制过程还具有反式激活作用，其与病毒颗粒共同由细胞内释放，是病毒形成完整外膜的重要标志，与血清HBVDNA拷贝数具有良好的相关性，能反映患者机体内乙肝病毒复制情况[6。最近的研究还发现HBV-LP对于肝细胞具有直接毒性，是导致肝细胞损伤的主要原因。以往的关于HBV-LP的检测是通过检测其独有片段Pre-S1蛋白来实现的，但是编码Pre-S1蛋白的Pre-S区具有较为复杂的拓扑结构导致Pre-S1抗原的检出率较低，不能很好的反映HBV的复制情况，而采用针对其复杂构象结构的单抗检测，发现与DNA的符合率、平行关系更为明显。目前在乙肝的治疗中核昔类似物已有了广泛的应用，但由于持续免疫压力、长期治疗、前C和C启动子变异等因素导致HBeAg阴性慢乙肝明显增多，故HBeAg阴转并不能排除病毒的感染与复制。作为HBV-LP则是较HBeAg敏感的反映HBV感染与复制的血清学指标，其出现在病毒感染的早期，其阴转是病毒清除的最早迹象，相对含量的消长可提示疾病的预后，若持续阳性则提示感染慢性化和疾病持续活动，是HBeAg阴性和(或)HBVDNA阴性的慢乙肝患者的病毒复制、抗病毒疗效及预后判断的监测指标〔},s}0由于HBV-LP能更好地反映HBV的复制情况，而且如果通过ELISA方法进行检测，将使其在多数医疗机构都能开展。尤其对于基层医疗单位，由于HBVDNA检测相对复杂，需要有专用PCR实验室和设备，在不具备PCR实验条件时，HBV-LP的检测具有不可低估的临床价值。另外，HBV-LP和HBVDNA联合检测又可以作为HBV检测的有益补充。因此，我们在既往工作的基础上建立了HBV-LP的ELISA检测方法，并且对所建立方法的性能进行了评价，为进一步的临床应用研究奠定了基础。4参考文献 Paran N,Cooper A,Shaul Y. Interaction of hepatitis B virus with cells[J].Rey Med Virol,2003.137-143.Thursz M,Yee L,Khakoo S. Understanding the host genetics of chronic hepatitis B and C[J].{H}Seminars in Liver Disease,2011.115-127.Xie Y,Zhai J,Deng Q. Entry of hepatitis B virus:mechanism and new therapeutic target[J].{H}Pathologie et Biologie,2010.301-307.冯仁青,郭振泉,宓捷波. 现代抗体技术及其应用[M].{H}北京:北京大学出版社,2006.焦奎,张书圣. 酶联免疫分析技术及应用[M].{H}北京:化学工业出版社,2004.Bruss V. Hepatitis B virus morphogenesis[J].{H}World Journal of Gastroenterology,2007.65-73.毛远丽,李伯安,马洪滨. 乙肝患者外膜蛋白血清学检测及对于判定HBV DNA复制的意义[J].{H}中华实验和临床病毒学杂志,2006,(3):276-278.doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2006.03.024.Niedre-Otomere B,Bogdanova A,Bruvere R. Posttranslational modifications and secretion efficiency of immunogenic hepatitis B vims L protein deletion variants[J].{H}VIROLOGY JOURNAL,2013.63.