高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的CHO细胞株的建立
发表时间:2014-10-17 浏览次数:1292次
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种严重威胁人类生命健康的传染病。我国是HBV感染高发区,流行病学调查显示:我国约有7一8亿人感染过HBV,乙肝病毒携带者占到总人口数的7.8%}'},临床上相当比例的HBV感染者会发展成为慢性肝炎、肝硬化或原发性肝癌〔z}。目前应用最广泛的基因工程乙肝疫苗主要分为酵母表达和CHO细胞表达两种。后者表达的HBsAg具有阳转率高、免疫原性强等特点,但其表达量低,远不能满足市场需求。本研究通过优化设计构建了真核表达载体,将该载体转染CHO细胞,检测了其HBsAg的表达量以及抗原活性。材料与方法1.1质粒、细胞系及细胞培养含二氢叶酸还原酶(曲斤一)基因的表达载体由中山大学李庆教授馈赠。CHO-DG44细胞来自北京五加和分子医学研究所有限公司。该细胞只有在含脯氨酸,次黄P}吟和胸腺嚓陡脱氧核昔酸的培养液中才能正常生长。1.2主要试剂基因合成、限制性内切酶、质粒、提取和柱式胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;转染试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司的FuGENE6转染试剂盒;无血清培养基、胰蛋白酶、氨甲喋吟购自美国Gibco公司;乙型肝炎表面抗原检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司。1.3基因合成与表达质粒的构建根据GenBank中的HBV基因序列,选取我国乙肝病毒主要血清型(adr型)S区基因序列,经优化稀有密码子后进行基因合成。将表达载体和S区基因分别用Hindj[[和XbaI进行双酶切、电泳回收S基因片段,并将两者用T4DNA连接酶连接,转化含Amp的L.B平板,获得插人克隆载体,并验证获得的目的片段插人表达载体,命名为pY-S。1.4重组质粒的大量制备采用碱裂解法大量提取质粒pY-S,经过氯化艳密度梯度离心后,回收超螺旋状态质粒,经透析、沉淀、干燥、溶解后,于一20℃保存备用。1.5细胞转染和表达HBsAg细胞株的筛选酶切质粒后得到线性化的质粒,纯化回收转染备用。将CHO细胞以250000个细胞/孔接种于六孔板中,至转染当日细胞数量铺满孔底的80%。按照美国Roche公司转染试剂盒FuGENE6的说明书进行质粒转染,培养至3d后出现阳性克隆,胰酶消化挑出多个生长旺盛的单克隆扩大培养。用含1x10-8mol/LMTX的无血清培养基加压培养,每4d换一次液,经20余天培养,生长出抗性细胞群,采用ELISA法测定细胞培养上清液中HBsAg的表达量。将抗性细胞用胰酶消化,再依次使用含1x10-'mol/L,5x10一'mol/L,lx10一6mol/L,4x10一6mol/LMTX的无血清培养基加压培养,最后筛选出含4x10-6mol/LMTX的抗性细胞群,采用乙肝表面抗原HBsAg试剂盒进行ELISA检测。[311.6细胞培养上清中表达蛋白的形态学观察制备40%的氯化艳密度梯度,35000g离心12h后在相应位置小心取出超速离心纯化的产物,滴加于铜网上,用3%的磷钨酸进行负染,之后置于电镜下观察其形态特征。2结果2.1构建转染质粒的酶切鉴定将构建的转染质粒经HindIII和XbaI进行双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,所切片段与预期相符,见图1,表明表面S基因已经成功插人表达载体pY-S中。2.2高效表达HBsAg细胞株的筛选经过含4x10-}mol/LMTX无血清培养基培养10余天,选择其中表达量高的三株细胞群C401,C602,0801进行放大培养。细胞培养物上清的乙肝表面抗原ELISA检测结果见图2,结果显示使用4x10-6mol/L的MTX加压筛选后,细胞培养上清中的HBsAg滴度能够达到1:5000,而使用1x10-'mol/L和5x10-'mol/LMTX加压筛选的细胞群表达的HBsAg滴度分别为1:160和1:64。2.3离心纯化后表达蛋白的电镜观察经氯化艳密度梯度离心纯化后的HBsAg经3%的磷钨酸负染,在电镜下可见大量的小球型颗粒,直径约为20一22nm,与HBsAg颗粒的预期大小相符。另外,还可见少量的管型颗粒,电镜下观察到的这两种形态均符合典型的HBsAg形态学特征,如图3所示。3讨论乙肝疫苗能够有效阻断乙肝病毒感染,基因工程疫苗是第二代乙肝疫苗,具有生产规模大,原料不受限;无感染性,安全性好,免疫原性强等优势。国产基因工程乙肝疫苗主要有两种,分别来自酵母和CHO细胞表达系统,其中以基因工程酿酒酵母乙肝疫苗占据主要市场。酵母系统培养条件比较简单,易于大规模生产,但不能分泌,也无糖基化。CHO系统表达产物可分泌,且糖基化,但生产条件要求严格,成本较高。由CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强,阳转率高的优点,目前应用较多的是CHO/dhfr一表达系统厂4}0目前国内CHO细胞表达系统主要存在的问题是产量低,48h产量在2一10mg/L之间变动,酶标免疫检测的滴度水平大多在1:1024以下,HBsAg表达量低主要与表达蛋白的分泌率低有关。我们通过优化乙肝病毒S基因的序列、引进新型CHO表达载体的办法,试图提高HBsAg的胞内表达水平,促使其大量向胞外分泌,以期提高HBsAg的表达产量,为乙肝疫苗的生产提供高表达量HBsAg的CHO表达系统。本研究选用的CHO细胞表达系统是一种成熟的真核表达细胞,因为其适应无血清悬浮培养,给后期的蛋白纯化带来巨大便利,消除了含血清培养中的许多未知因素的干扰,有利于研究成果的产品化要求。构建的pY-S质粒成功转染CHO细胞后,经过3轮筛选过程,重组细胞在含MTX的筛选培养基中生长,逐步增加MTX的浓度,使CHO细胞中转染的S基因拷贝不断增加。经检测证实,不同MTX浓度下HBsAg的表达量显著不同。其中4x10-}组HBsAg的滴度为1:5000,而1x10-'和5x10-'组滴度分别为1x640和1x160。说明本重组细胞株表达的HBsAg有较高的表达量,具有进一步研究的价值。在HBV感染者体内存在三种主要的病毒颗粒形式,分别为Dane颗粒,小球型颗粒以及管型颗粒,小球型颗粒和管型颗粒主要由HBsAg组成。本研究中,电镜的观测结果显示为CHO无血清培养系统表达制备的HBsAg,与其天然存在小球型和管型颗粒在形态学上完全一致,具有天然乙肝病毒表面抗原颗粒的空间结构特征。在CHO细胞染色体上存在数量众多的外源基因整合位点,仅有极少数位点能产生高水平表达,这样就需要大量的细胞克隆筛选工作才能得到真正的高表达的细胞株。在进行扩增后,还需要筛选出适合生长的高表达量细胞株。因此,还需要大量的筛选才有可能得到一株符合要求的高产细胞株。4参考文献 Liang XF,Bi SL,Yang WZ. Epidemiological serosurvey of Hepatitis B in China-Declining HBV prevalence due to Hepatitis B vaccination[J].{H}VACCINE,2009.6550-6557.Yuen MF,Hou JL,Chutaputti A. Hepatocellular carcinoma in the Asia pacific region.Asia Pacific Working Party on Prevention of Hepatocellular Carcinoma[J].{H}Journal of Gastroenterology and Hepatology,2009.346-353.任贵方,张一鸣,阮微琴. 乙型肝炎病毒表面抗原基因在中国地仓鼠卵巢细胞中的高效表达及纯化抗原免疫原性的研究[J].{H}病毒学报,1987.313-320.膝小锘,易小萍,孙祥明. 表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养[J].{H}中国生物制品学杂志,2010.1080-1083.张艳,时成波,郭丽. HBsAg真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达[J].{H}中国实验诊断学,2007,(10):1287-1289.doi:10.3969/j.issn.1007-4287.2007.10.003.李萍,蒋琳,黄思扬. 中华仓鼠卵巢(CHO)工程细胞无血清培养的研究[J].{H}微生物学免疫学进展,2004,(4):46-50.doi:10.3969/j.issn.1005-5673.2004.04.013.