拉米夫定治疗失代偿乙型肝炎肝硬化的疗效与HBV基因型及细胞毒性T淋巴细胞的关系

　　HBV不同基因型存在不同的特点，根据其基因序列不同，HBV可分为A一H共8种基因型，我国以B基因型和C基因型为主。C基因型感染者血清HBVDNA水平较高，肝组织学活动度较高，ALT反复或持续波动，对干扰素、拉米夫定等核普(酸)类似物治疗应答均不及B基因型感染者，HBV不同基因型感染者为什么会出现这种情况，目前还不十分清楚。目前已较一致的认为，机体对病毒所产生的特异性细胞免疫应答可能是清除机体内病毒的重要因素，我们的前期研究发现，与慢性乙型肝炎(CHB)B基因型感染者相比较，C基因型感染者的HBV特异性CTL水平较低，本研究测定了80例失代偿乙型肝炎肝硬化患者的HBV基因型和HBV特异性CTL，观察B,C基因型感染者的HBV特异性CTL水平的差异，并用拉米夫定治疗，探讨拉米夫定对B,C基因型感染者的疗效差异与HBV特异性CTL的关系。　　1对象与方法　　1.1对象选择80例失代偿乙型肝炎肝硬化患者，为2008年6月至2011年6月无锡地区的患者，诊断符合2005年中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》失代偿乙型肝炎肝硬化的诊断标准4]。纳入标准:HBVDNA阳性(HBVDNA,31og10拷贝/ml),HBeAg阳性、人白细胞抗原(HLA)一A2阳性、18岁以上的成年人。排除标准:所有患者排除甲型、丙型、丁型、戊型病毒的感染，无自身免疫性疾病史，无嗜酒史，无肝毒性药物使用史，未用过核普(酸)类似物和干扰素等抗病毒药物或免疫调节剂。80例失代偿乙型肝炎肝硬化患者中，B,C基因型各40例，B基因型40例中，男性26例(65%)，女性14例(35%)，平均年龄(52.5519.11)岁，40例的HBVDNA,(3一7)1og10拷贝/ml，平均(4.5510.22)1og10拷贝/ml,ALT(102士22)U/L,C基因型40例，男性27例(67.5%)，女性13例(32.5%)，平均年龄(52.63士8.79)岁，40例的HBVDNA,3一71og10拷贝/ml，平均(4.6310.23)1og10拷贝/ml,ALT(109士32)U/L，两组HBVDNA,ALT水平、性别、年龄比较差别无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。　　1.2方法　　1.2.1HBVM和HBVDNA的检测:HBVM(HBsAg、抗一HBs、HBeAg、抗一HBe、抗一HBc):1235时间分辨荧光法，上海新波试剂检测,HBVDNA用实时荧光定量PCR法，上海科华试剂检测。　　1.2.2HLA-AZ等位型的鉴定:取100闪肝素钠抗凝新鲜全血，加人检测管和对照管，分别加人HLA-AZ-PE及同型对照10闪，室温避光孵育30min，经溶血处理后用流式细胞仪(Beckman-coulter3XL)检测，试剂购自英国Proimmune公司。　　1.2.3外周血HBV特异性CTL的检测:试管中加人10闪藻红蛋白标记的HLA-肤四聚体，1闪HBVcore18-27抗原肚和CD，一异硫氰酸荧光素、CD3-PCS，再加人100闪的肝素抗凝血，同时做同型对照，混匀室温避光孵育20min，溶血洗涤后上流式细胞仪检测，以CD犷淋巴细胞设门计数50000个CD扩细胞，同时计数CDg"和HLA-肤四聚体双阳性细胞为特异性CD扩细胞，并以占总计数CD扩细胞的百分比表示，所用试剂购自美国Beckmancoulter公司。　　1.2.4HBV基因型的检测:采用PCR微板核酸杂交一ELISA技术，基因扩增仪PE9600型，美国PE公司生产，试剂为第一军医大学基础生物医学诊断研究中心提供。引物及探针:选择前C区的不同序列作为PCR引物和核酸杂交探针，6个基因型通用的序列作为PCR的引物和通用包被探针，而同一部位的不同序列作为各型的显色探针。显色探针5’标记生物素，由上海生物工程公司合成。引物序列为:引物W1:5'-CCCTTCTTCGTCTGCG-GTTCC-3'(nt1490-1510);引物2:5'-ACCAATTTAT-GCCTACAGCCTC-3'(nt1798-1777)，按说明书操作。　　1.3统计学方法用SPSS12.0软件进行统计分析，计数资料用犷检验，计量资料用t检验，P<0.OS差异有统计学意义。　　2结果　　2.1两组HBVDNA转阴B基因型感染者40例(100%),C基因型感染者治疗至9,10个月时各有1例发生YMDD变异加阿德福韦酷治疗，其余38例中HBVDNA转阴26例(68.42%),HBVDNA转阴率C基因型感染者低于B基因型感染者，=14.91,P<0.O1。　　2.2两组HBeAg转阴B基因型感染者18例(45%)，多于C基因型感染者(7例，18.42%),X2=6.32,P<0.O5。　　2.3两组HBV特异性CTL比较外周血HBV特异性CTL水平:治疗前，B基因型感染者「(0.33士0.03)%，高于C基因型感染者[(0.11士0.02)%},t=s.1z,P<o.of，治疗后1年:s基因型感染者[(0.44士0.04)%，高于治疗前，t=4.01,P<0.01，也高于C基因型感染者治疗后1年[(0.23土0.03)%」,t=5.63,P<0.01,C基因型感染者治疗后1年高于治疗前，t=4.，P<O.Olo2.4两组ALT恢复正常比较B基因型感染者38例(95%)，多于C基因型感染者(28例，73.68%),xzX=6.79，P<0.O1。　　2.5两组YMDD变异比较B基因型感染者0例，C基因型感染者2例(5%),XZ=2.05,P>0.050两组治疗后1年HBVDNA转阴、HBeAg转阴、ALT复正常比较见表1.　　3讨论　　慢性HBVC基因型感染者的抗病毒疗效不及B基因型感染者的机制不清楚。C基因型HBV诱导Tfh的产生低于B基因型HBV，因此C基因型感染者的Tfh水平低于B基因型.由于Tfh又可以分泌IL-21,IL-21能够增加病毒特异性CTL的增殖，由于C基因型感染者的Tfh水平低于B基因型，因此C基因型感染者的IL-21水平低于B基因型，而导致C基因型感染者的HBV特异性CTL的增殖差于B基因型，最后引起C基因型感染者的HBV特异性CTL水平低于B基因型。HBVDNA能促使程序性死亡受体一1(PD-1)在HBV特异性CTL表面的表达，导致HBV特异性CTL水平下降，本研究两组治疗后HBV特异性CTL水平均高于治疗前，可能与治疗后HBVDNA转阴有关，而B基因型感染者的HBVDNA转阴率高于C基因型感染者，因此B基因型感染者的HBV特异性CTL水平高于C基因型感染者。　　本研究发现，C基因型感染者的YMDD变异高于B基因型感染者，但无统计学意义(P>0.05)，可能由于病例数不多，观察时间较短有关。　　4参考文献　　Chan HL,Tsang SW,Liew CT. Viral genotype and hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic hepatitis B virus infection[J].{H}American Journal of Gastroenterology,2002.406-412.　　Chisari FV,Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis[J].{H}ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY,1995.29-60.　　Xibing G,Xiaojuan Y,Dong W. Comparison and significance of specific and non-specific cellular immunity in patients with chronic hepatitis B caused by infection with genotypes B or C of hepatitis B virus[J].Science in China Series C:Life Sciences,2009.719-723.　　中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南[J].{H}中华传染病杂志,2005,(6):421-429.　　Publicover J,Goodsell A,Nishimura S. IL-21 is pivotal in determining age-dependent effectiveness of immune responses in a mouse model of human hepatitis B[J].{H}Journal of Clinical Investigation,2011.1154-1162.　　Evans A,Riva A,Cooksley H. programmed death 1 expression during antiviral treatment of chronic hepatitis B:impact of hepatitis B e-antigen seroconversion[J].{H}HEPATOLOGY,2008.759-769.