持留菌的研究进展

　　近年来越来越多的研究表明一些公认的微生物难题，包括潜在的细菌感染、慢性感染的治疗失败以及细菌生物膜的多药耐受性，都与持留菌相关。　　持留菌大概占细菌种群的0.001%一0.1%，是指在高药物浓度下呈现出对药物的耐受性，进人休眠状态，而在抗生素压力消除之后，部分细菌又可恢复生长繁殖再生，同时对之前的抗生素保持敏感，而这部分细菌并没有基因的突变，与被杀灭的细菌保持同源性，生存下来的细菌就被称为“持留菌”。　　一、持留菌形成机制的研究　　持留菌的概念最早是1944年由Bigge:提出，他发现金黄色葡萄球菌在高浓度青霉素下没有全部被杀灭，有一小部分细菌存活了下来，当把青霉素撤除之后这小部分细菌重新增殖，重新增殖的金黄色葡萄球菌同样对青霉素保持敏感，但仍剩下一小部分细菌存活，他把这小部分细菌称为持留菌，并认为这部分细菌不被杀死的机制是细菌处于一种休眠的状态。研究持留菌的形成机制，可以从源头上控制由各种持留菌所引起的感染，但目前还没有一个确切的理论，其中以细菌的毒素/抗毒素(TA)分子机制较为肯定，研究认为TA分子的表达与细菌的休眠状态有关[3]。　　TA分子是由两个基因组成的操纵子，其中一个基因编码一个稳定的毒素蛋白(可抑制一些重要的细胞功能)，另一个基因编码一个不稳定的、可以对毒素蛋白进行中和的抗毒素蛋白，该蛋白对毒素蛋白的表达具有自动调节作用。有研究者认为TA分子可在细胞处于逆境的胁迫下(如饥饿、抗生素作用、DNA损伤、热击等)诱发细胞程序死亡，但更多的研究证明，TA分子并非导致细胞的死亡，而是抑制某些大分子的合成，从而对细菌生长进行可逆地抑制[4]。由于细菌的染色体有多对TA系统，比如大肠埃希菌至少有37对气其中的MqsR/MqsA是第一对被证明在持留菌形成过程中起作用的TA分子，把MqsRMaSA基因或单独把MqsR基因删除可以减少持留菌的形成，同时增加MqsR基因表达产物，可使持留菌的数量增加，而且相对于非持留菌MqsR更多表达于持留菌。　　二、生物膜持留菌和游离持留菌的比较细菌生物膜系指勃附于活体或无活性物体表面，被自身分泌的基质包绕的有一定结构的细菌群体，是细菌为了适应恶劣环境、维持生存的特殊存在形式，具有极强的耐药性和免疫逃避性。美国CDC资料表明，发达国家中65%的人类疾病都是由生物膜感染所致，如导致囊性纤维化不治之症的铜绿假单胞菌，导致体内器官感染的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等都是通过生物膜的形式进行感染。　　医学实践证明，绝大多数生物膜感染性疾病具有高复发性和难彻底治愈性，从而成为医学突破的一大瓶颈。　　研究表明，微生物生物膜中的持留菌数量比游离微生物细胞群体中的持留菌数量高100一10000倍，与之相对应，生物膜对抗生素的耐受能力比游离微生物细胞高10一100倍。在高浓度的杀菌型抗菌药物作用下，绝大多数致病性生物膜内细胞与游离细胞可被杀死，持留菌则通过进人休眠状态得以存活;游离的持留菌随后可被机体的免疫系统进一步清除，而生物膜中大量多聚物的存在可保护膜内持留菌免受免疫系统的攻击。因此，生物膜中的持留菌能够在抗菌药物与免疫系统的双重攻击下幸存;当停止用药或用药间隔过长时，在非药物或低浓度药物环境下，生物膜内存活的持留菌恢复生长和增殖，再生出新的致病菌，导致继发感染。但有实验表明，即使把生物膜持留菌和游离持留菌胞外的多聚物提取出来，然后用杀菌剂邻苯二甲醛(OPA)作用，结果表明这两种不同的持留菌都被灭活，但两者所用的最低杀菌浓度(MBC)不同，游离持留菌的MBC为(0.55士0.20)mmol/L，生物膜持留菌的MBC为(1.7士0.30)mmol/L。经过杀菌剂OPA治疗之后，游离持留菌在超过48h之后仍然处在灭活的状态，而部分被灭活生物膜持留菌24h恢复生长，这部分持留菌的恢复随着时间的推移而增加，再次恢复生长的生物膜持留菌的MBC为(0.58士0.40)mmol/L,与之前的游离持留菌的MBC相近，表明生物膜持留菌可能在杀菌剂作用下仍然能够存活[14]。　　三、持留菌与耐药菌的关系持留菌恢复生长之后仍然保持对之前抗生素的敏感性，与之前在高浓度药物被杀灭的细菌相比，只表现出表型的变异，并没有基因的突变，其基因与被杀灭的细菌保持同源性，说明持留菌并不是耐药菌，它和耐药菌有着最本质的区别。但持留菌长时间处于较高抗生素压力选择作用下，很容易发生基因变异而形成遗传型耐药菌株，实质上持留菌为遗传型耐药菌株的产生提供了一个平台，持留菌群体的数量变化明显影响生物膜耐药菌株的产生频率，Lewis认为持留菌是细菌生物膜具有超强耐药性的真正原因，并且与临床上常见的慢性反复性感染和难以彻底治愈的疾病有密切关系。　　四、清除持留菌的方法研究　　1.利用小分子化合物靶向杀灭持留菌　　在化学文库中筛选那些对持留菌的关键基因产生有影响的候选化合物，然后联用现有抗菌药物，利用具有杀菌效果的抗菌药物将绝大多数致病微生物杀灭，同时应用候选化合物清除持留菌，杀灭致病微生物群体。这一方法的关键是确定持留菌关键基因，然后以持留菌的关键基因为靶标，应用高通量药物筛选技术，从化学文库中初步筛选阻碍持留菌合成的候选小分子化合物。有报道化合物C10具有选择性杀灭持留菌活性，C10就是利用自动化操作系统的高通量药物筛选法从化学文库筛选出来的。　　2.唤醒休眠状态的持留菌唤醒休眠状态的细菌，使其恢复生长，恢复对抗生素的敏感性。Jochum等通过对铁镁等营养元素的限制使细菌复苏后失去对抗生素的抗性，这种方法配合抗生素可以杀灭99%的生物膜持留细菌。Alliso。等通过尿路感染小鼠模型实验证实，抗生素加碳水化合物可杀灭99.9%的持留菌(大肠埃希菌)，碳水化合物可引诱休眠的细菌，使其醒来，更容易受到抗生素的攻击，而单纯的抗生素治疗的对照组无效。　　3.防止或减少持留菌的生成　　目前已发现了持留菌形成的一些关键基因，以这些基因为靶基因合成药物早期应用可以抑制持留菌的生存而不是后续的杀菌治疗。　　五、结语　　综上所述，目前关于持留菌形成的机制还没有完全的定论。国内对持留菌的研究还处于初级阶段。持留菌与临床难治性慢性感染有着极大的联系，充分认知持留菌的生物学特性与产生机制，探索目前现实可行的清除方法，以彻底杀灭致病微生物群体，从而为难治性慢性感染提供新的治疗策略和途径，研究成果必将对临床难治性慢性感染的治疗和预防耐药菌的产生有着极其重大的意义。　　参考文献　　Lewis K. Persister cells[J].Annual Review of Microbiology,2010.357-372.　　Bigger JW. Treatment of staphylococcal inffections with penicillin by intermittent sterilisation[J].The Lancet,1944,(6320):497-500.　　Lewis K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells[J].Current Topics in Microbiology and Immunology,2008.107-131.　　Van Melderen L,Saavedra De Bast M. Bacterial toxin-antitoxin systems more than selfish entities[J].PLoS Genetics,2009,(03):e1000437.　　Tan Q,Awano N,Inouye M. YeeV is an Escherichia coli toxin that inhibits cell division by targeting the cytoskeleton proteins,FtsZ and MreB[J].Molecular Microbiology,2011,(01):109-118.　　Kim Y,Wood TK. Toxins Hha and CspD and small RNA regulator Hfq are involved in persister cell formation through MqsR in Escherichia coli[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,(01):209-213.doi:10.1016/j.bbrc.2009.11.033.　　Shah D,Zhang Z,Khodursky A. Persisters:a distinct physinlogical state of E.coli[J].BMC Microbiology,2006.53.　　Lewis K. Persister cells,dormancy and infectious disease[J].Nature Reviews Microbiology,2007,(01):48-56.　　Mack D,Becker P,Chatterjee L. Mechanisms of biofilm formation in Staphyktoccus epidermidids and Staphylpccus aureus:functional molecules,regulatory circuits,and adaptive response[J].International Journal of Medical Microbiology,2004,(2/3):203-212.doi:10.1016/j.ijmm.2004.06.015.　　Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP. Bacterial biofilms:a common cause of persistent infections[J].Science,1999,(5418):1318-1322.