硫化氢对再生肝细胞中细胞周期蛋白D1和p21Cip/WAK-1的影响

　　肝细胞再生不足是重型肝炎死亡率居高不下(70%)主要原因，这与细胞再生调节机制复杂有关。我们前期发现，硫化氢抑制肝细胞的增殖并参与增殖通路的调节一2，但是对细胞增殖周期的调节仍未明确，本研究观察硫化氢对细胞周期蛋白(CyclinDl)和p21Cip/WAK-1的作用，进一步阐明硫化氢作用机制，为重型肝炎治疗提供思路。　　材料与方法　　一、肝细胞的处理　　肝穿刺获取43例慢性乙型肝炎患者的肝组织，患者本人知情同意。人选患者均为杭州市第六人民医院住院的慢性乙型肝炎患者，其中男26例、女17例，平均年龄(32.0士7.2)岁，HBsAg,HBeAg,抗一HBc阳性，HBVDNA>105拷贝/mL,ALT,AST50一150IU/L，胆红素7.9一21;}mol/L。肝组织获得和细胞分离见文献〔2]。　　采用两步法冻存肝细胞:取无菌冻存管(2mL)1支将细胞用冻存液(RPMI1640+30%FBS+双抗+0.1U/mL胰岛素+2%DMSO)制成1x105/mL细胞悬液，置-20℃2h后冻存于一70℃冰箱内冻存。冻存肝细胞复苏，调肝细胞浓度为5x103/mL,分别给予促肝细胞生长素(HGF组)，炔丙基甘氨酸(PPG,2mmol/L)和HGF(PPG+HGF组)，硫氢化钠(NaHS,lmmol/L)+HGF(NaHS+HGF组)，剩余1份作为空白对照组，每组设3个复孔，培养24h后用于细胞增殖能力及活力评价等。　　二、方法　　1.细胞增殖能力及活力评价　　用台盼兰拒染实验检测培养24h后的肝细胞细胞活力，MTT法评估增殖能力。　　2.硫化氢测定　　采用去蛋白方法测定上清液中硫化氢含量。首先在试管中加人0.5mL10剔L醋酸锌，然后加人0.1mL上清样本，振荡混匀，再依次加人0.5mL对氨基二甲基苯胺盐酸盐(20mmol/L)和0.5mL三氯醋酸(30mmol/L)，再加人2.5mL蒸馏水补足体积至5mL，充分混匀,6000r/min离心5min(离心半径8cm)，吸出上清液，用分光光度计在670nm处检测吸光度。根据硫化氢标准曲线计算上清液中的含量。　　3.硫化氢对肝细胞禅1Cip/WAIF一1和CyclinDl的影响。　　采用免疫(Western)印迹法。肝细胞培养24h后，800xg离心5min收集细胞，加蛋白上样Buffer300匹，超声粉碎细胞(350J,5s)，煮沸5min，冰上冷却，上样，PAGE电泳，PVDF膜印记，脱脂奶粉封闭1h，p21Cip/WAK-1,CyclinD1,(3-actin一抗4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育Ih,ECL显色。　　4.硫化氢对各组DIVA复制的影响　　将细胞常规消化，PBS洗2次，离心后沉淀中加人2mLNaCl(10mmol/L)、10mmol'LTris-HC1,10mmol/LEDTA缓冲液(TE)重悬细胞。再加人20%十二烷基磺酸钠(SDS)100扭L,混匀，加人20mg/znL，蛋白酶K10ML,37℃过夜。加人饱和酚(pH8.0)2mL，离心后上清中加人1mL饱和酚,1mL24:1氯仿:异戊醇混合液离心，取上清再加人24:1氯仿:异戊醇混合液，离心后上清加人3mol/L乙酸钠(NaAc)200FxL,4mL预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜。应用70%乙醇洗涤后，溶于50一100江TE中。于1%琼脂糖凝胶中以100V电压电泳，紫外灯下观察。　　三、统计学分析　　正态分布数据用x1、表示，用SPSS13.0统计学软件对数据进行方差分析，两组之间比较用t检验，P<0.05为差异有统计意义。　　结果　　一、肝细胞增殖能力及活性鉴定　　肝细胞经过冻存后复苏，再培养24h，台盼兰拒染实验显示细胞活性>90%}MTI'法吸光度670nm测定显示:与对照组相比，HGF组肝细胞增殖明显(t=6.943,P<0.01);与HGF组相比，PPG+HGF组肝细胞增殖明显增强(t=4.017,P<0.05)，而NaHS+HGF组肝细胞增殖明显减弱(t=5.328,P<0.05),以上组别比较，差异均有统计学意义，详见表1。　　二、各组上清液中硫化氢含量的比较　　HGF组细胞上清液中硫化氢较对照组明显减少(t=3.411,P<0.05);PPG+HGF组较HGF组明显减少(t=8.671,P<0.01);NaHS+HGF组较HGF组明显增加(t=23.328,}<tJ.02)。两组数据比较差异均有统计学意义，见表1。三、肝细胞p21Cip/WAK-I和C}"clinDI的表达Western结果显示HGF促进肝细胞增殖时，Cv-clinD1表达上升，p21Cip/WAK-I表达下降二增加NaHS后，p21Cip/WAK-1表达上升，CyclinD1表达下降，加用PPG后，呈相反趋势。详见图to四、各组DNA表达量的变化情况肝细胞加HGF刺激后，DNA复制增强;增加NaHS,DNA无明显复制;加用PPG后，DNA复制增加。详见图2.　　讨论　　肝脏是全身硫化氢产生和代谢的主要器官，是全身体液中硫化氢的调节中心，尽管研究显示硫化氢干扰肝细胞的再生，但具体机制仍未明确[20本研究显示硫化氢促进肝细胞p21Cip/WAK-1的表达和抑制CyclinD1表达，说明硫化氢能抑制细胞周期的启动，与文献吻合。p21Cip/WAK-1是p53的下游，通过与PCNA形成复合物，抑制细胞的DNA合成[5-6]。硫化氢增加P21Cip/}TAK-1表达后，细胞DNA表达量无明显改变，反之增加，改变趋势与细胞增殖趋势一致，表明硫化氢可以通过p21Cip/WAK-1抑制细胞DNA的复制，进而抑制细胞增殖。CyclinD1是调控细胞周期G1期的关键蛋白，促进E2F转录因子释放，起始转录激活细胞周期的基因，推动细胞G1时期进人到S期。本文显示硫化氢使CvclinDl表达减少，可能会阻止细胞从G1期进入到S期，从而阻止DNA复制和细胞增殖。　　有研究显示低浓度硫化氢(1pmol/L)可以通过自由基损伤DNA，本实验浓度下硫化氢减少DNA含量的情况不明显，具体机制有待更深层次的研究。同样，硫化氢对细胞周期的调节还需更深人的研究，如流式细胞仪检测细胞周期的转换等。尽管如此，本研究结果仍提示硫化氢可能通过抑制细胞周期蛋白CyclinD1和增加p21Cip/WAK-1表达抑制肝细胞增殖。　　参考文献　　周永裕. 肝细胞生长素治疗重症肝炎40例的疗效观察[J].广西医学,2000,(04):800-801.doi:10.3969/j.issn.0253-4304.2000.04.068.　　王新国,张思泉,刘华峰. 硫化氢对肝细胞增殖RAS-ERK通路的影响[J].浙江实用医学,2012,(04):248-249.　　Norris EJ,Culberson CR,Narasimhan S. The liver as a central regulator of hydrogen sulfide[J].Shock,2011,(03):242-250.　　Yang G,Cao K,Wu L. Cystathionine gamma-lyase overexpression inhibits cell proliferation via a H2 S-dependent modulation of ERK1/2 phosphorylation and p21Cip/WAK-1[J].Journal of Biological Chemistry,2004,(47):49199-49205.　　Yew TL,Chiu FY,Tsai CC. Knockdown of p21(Cip1/Waf1)enhances proliferation,the expression of stemness markers,and osteogenic potential in human mesenchymal stem cells[J].Aging Cell,2011,(02):349-361.　　Mehrara BJ,Avraham T,Soares M. p21cip/WAFis a key regulator of long-term radiation damage in mesenchyme-derived tissues[J].Federation of America Societies for Experimental Biology Journal,2010,(12):4877-4888.　　Attene-Ramos MS,Wagner ED,Gaskins HR. Hydrogen sulfide induces direct radical-associated DNA damage[J].Molecular Cancer Research,2007,(05):455-459.