血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的实验研究

　　作者：张建鄂, 罗昌霞, 张庆红, 李涛

　　[摘要] 目的:研究血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的机制。 方法:血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)加入肾小管上皮细胞为对照组;体外培养的肾小管上皮细胞作为空白对照;不同浓度缬沙坦(10-6 μmol/l、10-7 μmol/l、10-8 μmol/l、10-9 μmol/l)先与肾小管上皮细胞共同培养半小时后再加入血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)为干预组;EMSA、RT-PCR分别检测不同时限NF-κB活性、骨桥蛋白mRNA表达。 结果:血管紧张素Ⅱ可诱导肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加，骨桥蛋白mRNA表达上调;而不同浓度缬沙坦干预组检测结果显示NF-κB活性、骨桥蛋白mRNA表达明显下调。 结论:血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤与导致肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加、骨桥蛋白mRNA转录上调有关。这一过程可能依赖血管紧张素ⅡⅠ型受体。

　　[关键词] 血管紧张素Ⅱ;肾小管上皮细胞;核转录因子-κB;骨桥蛋白

　　AngiotensinⅡInduces the Injury of Proximal Tubular Cells

　　ZHANG Jian-e, LUO Chang-xia, ZHANG Qing-hong, LI Tao

　　(Department of Nephrology, Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000,China)

　　Abstract： Objective To explore the mechanism of angiotensinⅡinducing the injury of proximal tubular cells. Methods Cultured cells were incubated with AngiotensinⅡ(10-7 μmol/l)as the control; cultured cells were incubated with different concentration Xiesartan for half an hour and then with angiotensinⅡ(10-7μmol/l) as the intervention group; proximal tubular cells without stimulation as blank control; EMSA, RT-PCR were used to observe NF-κB activity and OPN mRNA expression in different periods,respectively. Results AngiotensinⅡcould increase NF-κB activity and upregulate OPN mRNA expression in proximal tubular cells.While Xiesartan could decrease NF-κB activity and downregulate OPN mRNA expression in angiotensinⅡ stimulated proximal tubular cells. Conclusion The mechanism of angiotensinⅡ inducing the injury of proximal tubular cells is related to increase NF-κB activity and upregulate OPN mRNA expression,and this process is angiotensinⅡ receptorⅠ dependent.

　　Key words: AngiotensinⅡ; Proximal tubular cell; NF-κB; OPN

　　近年来，肾脏局部肾素―血管紧张素―醛固酮系统(RAS)在慢性肾脏病的发生、发展中的重要作用越来越受到人们的关注。RAS的主要效应因子血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)已发现与许多肾脏疾病的发生、发展过程密切相关。但血管紧张素Ⅱ能否诱导小管上皮细胞损伤及其具体机制不明。本课题通过体外实验用一定浓度血管紧张素Ⅱ刺激肾小管上皮细胞，观察核转录因子、细胞因子的变化，探讨血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器测定NF-κB活性的EMSA试剂盒(promega公司);血管紧张素 Ⅱ(sigma公司);RT-PCR试剂盒(BD Bioscience公司);TRIZOL(GiBco公司);RNaseA抑制剂(Novagen 公司);引物(上海生工生物工程技术公司);大鼠的肾小管上皮细胞株(NRK细胞)购至中科院上海细胞库;冷冻离心机(Biofuge公司)，二氧化碳温箱(Forma scientific公司)。缬沙坦由北京诺华公司提供。

　　1.2 细胞培养无菌条件下大鼠肾小管上皮细胞株，0.25%胰酶消化2 min，观察细胞分散成拉网状，终止消化，加入RPMI 1640培养液(含20%胎牛血清，300 mg/l谷氨酰胺、青霉素、链霉素)反复吹打，并分装至培养皿，置于37 ℃二氧化碳温箱中孵育;反复传代，取第七代细胞实验用。

　　1.3 实验分组当传代细胞长至90%融合时换无血清培养液继续培养12 h。试验分组如下：①空白对照:未加刺激物的培养细胞。②对照组:血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)加入培养细胞，分别于12、24 h检测NF-κB活性; 12、24 h检测骨桥蛋白 mRNA表达水平;每个检测指标均设五个重复组。③干预组:不同浓度缬沙坦(10-6 μmol/l、10-7 μmol/l、10-8 μmol/l、10-9 μmol/l)加入培养细胞，半小时后再加入血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)，分别于12 h检测NF-κB活性;12 h检测骨桥蛋白 mRNA表达水平;每个检测指标均设五个重复组。

　　1.4 EMSA的操作步骤①核蛋白的提取Bradford法定量。②EMSA 的操作依试剂盒说明书(Cat#3050)进行NF-κB寡核苷酸探针[r-32p]ATP标记及EMSA法测定NF-κB活性。NF-κB同序寡核苷酸探针序列为3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′;5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′。反应结束后，在4%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2 h(电压150 V，电泳缓冲液为0.5×TBE)。电泳完毕后干胶， -70 ℃放射自显影。电泳结果经密度扫描仪进行半定量分析。

　　1.5 骨桥蛋白的RT-PCR操作步骤培养细胞接种至12孔培养板，当细胞长至80%～90%融合时换无血清培养液，12 h后按试验分组加药物干预，每组细胞均设五个复孔。①TRIZOL提取总RNA，并测定浓度及260/280 nm的吸光度(A)值。②按T1TANIUMTM one-step RT-PCR试剂盒说明进行操作。反应条件：50 ℃ 1 h，90 ℃ 5 min; 94 ℃ 30′，65 ℃ 30′， 68 ℃ 1 min 30个循环;68 ℃延伸2 min，4 ℃保存。骨桥蛋白上游引物序列：5′AAGCCTGACCCATCTCAGAA 3′; 骨桥蛋白下游引物序列为： 5′GCAACTGGGATGACCTTGAT 3′，产物长度446 bp;设β-actin为内参照，其上流引物序列为5′-TCGTACCACTGGCATTGTGA-3′，下游引物序列为5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，产物长度545 bp。Mark片段选用2 000 bp。③电泳分析:取8 μl PCR扩增产物于质量浓度为1.5 g/l的琼脂糖凝胶上电泳，采用kodak scieuce凝胶图像分析系统扫描，并分析电泳条带，以OPN与β-actin的电泳条带光密度比值来作为OPN mRNA的相对表达量。

　　1.6 统计学处理全部实验数据采用均数±标准差(x±s)表示，差异的显著性采用单因素方差分析及q检验，以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 EMSA法测定结果(见图1)图1中1~7泳道的密度扫描值依次为：36.30±8.73,194.50±10.45,186.30±12.30,76.34±4.57,90.34±5.86,114.60±7.67,138.41±6.53;n=5(每组细胞均设五个重复组)。未加刺激的肾小管上皮细胞内NF-κB表达较弱;血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)刺激肾小管上皮细胞后NF-κB活性明显增高，以12 h最明显，为空白对照的5.47倍(P<0.05);24 h为空白对照的4.97倍(P<0.05);不同浓度缬沙坦12 h可抑制血管紧张素Ⅱ刺激的肾小管上皮细胞内NF-κB活性，抑制作用依次为10-6 μmol/l>10-7 μmol/l>10-8 μmol/l>10-9 μmol/l(P<0.05)。

　　图1 各组NF-κB活性的变化(略)

　　注: 1.空白对照;2.血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 12 h;3.血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 24 h;4、5、6、7泳道分别为10-6 μmol/l 12 h、10-7 μmol/l 12 h、10-8 μmol/l 12 h、10-9 μmol/l 12 h;

　　2.2 骨桥蛋白RT-PCR检测结果(见图2)1~7泳道OPN与β-actin的电泳条带的光密度比值依次为：1~7泳道依次为0.20±0.05，0.97±0.049，0.85±0.014，0.17±0.032，0.37±0.017，0.60±0.031，0.28±0.012;n=5;经过统计学分析，各组及组间相比均有显著差异，P<0.05。从结果分析：未加刺激的肾小管上皮细胞内骨桥蛋白转录较弱，而血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)诱导肾小管上皮细胞内骨桥蛋白转录增加，12 h达高峰，并持续至24 h;不同浓度缬沙坦可抑制血管紧张素Ⅱ刺激的肾小管上皮细胞骨桥蛋白的转录水平，抑制作用依次为10-6 μmol/l>10-7 μmol/l>10-9 μmol/l>10-8 μmol/l(P<0.05)。

　　图2 各组OPN mRNA水平的变化(略)

　　注：M:DNA Mark; 1、空白对照; 2、血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 12 h; 3、血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 24 h; 4、 5、6、7泳道分别为缬沙坦10-6 μmol/l 12 h、10-7 μmol/l 12 h、10-8 μmol/l 12 h、10-9 μmol/l 12 h。

　　3 讨论

　　肾脏局部肾素―血管紧张素―醛固酮系统(RAS)在慢性肾脏病进展中的作用已倍受重视， 血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂应用临床及动物实验研究证实，血管紧张素Ⅱ在小管间质病变中发挥重要作用[1]。近年来，大量研究结果表明[2]，肾小管间质病变较肾小球病变更密切相关于肾功能的损伤和预后。小管间质病变在进行性肾小球损伤中的重要性已经被越来越多的国内外学者所重视。在小管间质损害过程中肾小管上皮细胞扮演着重要的角色。但血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的具体机制不明。NF-κB作为一种重要的核转录因子，能与多种基因启动子或增强子上的κB位点发生特异性结合，并促进基因转录，参与许多基因，尤其是炎症与免疫相关基因的表达与调控。许多刺激，如：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、高糖、血小板活化因子、细胞因子等可激活NF-κB[3]。NF-κB游离并移入核内,调控炎症与免疫相关的基因的表达。在胞浆中还存在另一种蛋白质家族-IκB，它的主要作用是与NF-κB/Rel蛋白在胞浆中结合并使后者保持静息状态。NF-κB在核内与新合成的IκB结合后出核，进入胞浆，从而失活。本课题通过体外实验用血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)刺激肾小管上皮细胞， EMSA检测结果显示NF-κB活性升高，12 h达高峰，并持续至24 h，说明一定浓度血管紧张素Ⅱ可诱导肾小管上皮细胞NF-κB活性升高，与随后的炎症、纤维化基因的过度表达密切相关。骨桥蛋白是一种可以在肾小管上皮表达的高度酸化的磷蛋白，现认为它是巨噬细胞趋化因子。而在许多病肾实验模型上(包括缺血再灌注损伤)发现其表达上调。目前针对临床肾脏疾病的研究发现骨桥蛋白在伴有蛋白尿的肾小球疾病如微小病变性肾病、膜性肾病、IgA肾病的肾小管上皮细胞处高表达，均与小管间质纤维化密切相关[4-5]。本研究通过体外实验用血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)刺激肾小管上皮细胞，RT-PCR结果显示共同培养后骨桥蛋白的转录增加，在12 h达高峰并持续至24 h，与血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)诱导肾小管上皮细胞内NF-κB活性改变相一致，证实血管紧张素Ⅱ(10-7 μmol/l)可诱导肾小管上皮细胞内骨桥蛋白的转录增加，这可能与肾小管间质巨噬细胞浸润有关。通过对不同浓度缬沙坦共同培养的肾小管上皮细胞的测定，在相同刺激下其NF-κB活性及骨桥蛋白的转录水平明显降低，从实验角度说明缬沙坦用于慢性肾脏病的治疗机制与抑制血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞内NF-κB活性及骨桥蛋白的转录水平有关，因缬沙坦属血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体拮抗剂，我们推测血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞NF-κB及OPN mRNA活性上调依赖于血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体。通过本研究证实血管紧张素Ⅱ可诱导小管上皮细胞内NF-κB活性明显增加，骨桥蛋白转录增加，与炎性细胞小管间质浸润密切相关，并且这一过程依赖AGNⅡ Ⅰ型受体。但具体的信号转导途径仍需深入研究。

　　[参考文献]

　　[1] Lai KN,Chan LY,Tang SC,et al.Mesangial expression of angiotensin Ⅱ receptor in IgA nephropathy and its regulation by polymeric IgA1[J].Kidney Int,2004,66(4):1 403-1 416.

　　[2] Drumm K,Bauer B,Freudinger R,et al. Albumin induces NF-kappaB expression in human proximal tubule-derived cells (IHKE-1)[J].Cell Physiol Biochem，2002,12(4):187-196.

　　[3] Tomita N，Morishita R，Tomita S,et al. Inhibition of TNF-alpha, induced cytokine and adhesion molecule: expression in glomerular cells in vitro and in vivo by transcription factor decoy for NFkappaB[J].Exp Nephrol,2001,9(3):181-190.

　　[4] Kaimori JY,Takenaka M,Nagasawa Y,et al. Quantitative analyses of osteopontin mRNA expression in human proximal tubules isolated from renal biopsy tissue sections of minimal change nephrotic syndrome and IgA glomerulonephropathy patients[J]. Am J Kidney Dis,2002,39(5):948-957.

　　[5] 罗昌霞，张建鄂，屈振繁,等.NF-κB对尿白蛋白诱导肾小管上皮细胞骨桥蛋白转录的影响[J].郧阳医学院学报，2004，23(6)：332-335.

　　(郧阳医学院附属太和医院肾内科,湖北 十堰 442000)