丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞亚群的变化及意义

丙型肝炎病毒(HCV)感染是当今危害人类健康的最重要公共卫生问题之一。全球约有1. 7亿人感染HCV，而我国约占}. 4亿上’〕。持续的HCV'感染会 导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌等z-a。大量研究证实，多种宿主因素，例如:年龄、性别、饮酒、种族、合并 Hl3'} , HLV感染等以及宿主免疫状态均与HC}'感染疾病进展密切相关。越来越多的证据显示，机体免疫状态是决定HCV慢性感染后疾病进展快慢的最关键因素。机体感染HCV后，人体中淋巴细胞亚群间的平衡被打破，表现为外周血淋巴细胞亚群百分比、绝对数或功能改变，这些均在一定程度上反映了机体免疫状态的变化‘〕。目前，国内外相关的研究已经提出了不同年龄阶段的健康人群外周血淋巴细胞亚群的变化及参考值范围，这些淋巴细胞亚群参考值，为评价免疫相关性疾病的进展状态提供了重要的参考依据s-}}。然而，目前国内外还没有大样本丙型肝炎人群外周血淋巴细胞亚群的报道。本文回顾性分析了解放军三O二医院生物治疗研究中心2001年6月- 2009年12月期间采用FACSCalibur检测的未使用干扰素等药物治疗的241例丙型肝炎人群，并以以往报道的117例健康人群外周血淋巴细胞亚群频率作为对照s，提出了中国HCV感染人群不同疾病阶段的外周血淋巴细胞亚群分布范围，并重点分析了上述淋巴细胞亚群频率与年龄、性别以及疾病进程关系，从而为临床判断HC}'感染后机体的免疫状态、诊治及疗效评估提供参考依据。

1材料与方法

1. 1研究对象收集2001年6月-2009年12月期间解放军三O二医院生物治疗研究中心检测的 241例HC}} 感染人群(男149例，女92例)以及117例健康体检人群 (男69例，女48例)外周血淋巴细胞亚群频率;其中99% 以上是汉族。所有感染患者均未使用干扰素和利巴韦林药物治疗。根据中华医学会传染病与寄生虫病学会2000 年修订的《病毒性肝炎防治方案》，将HCV感染人群分为慢性肝炎(181例)、代偿期肝硬化(60例)。根据年龄段，将人群分为3一14岁(20例),15一49岁(130例)以及〕 50岁(91例)3个层次。

 1.2流式细胞检测方法采用的FAC}Calibur流式细胞仪购自美国BD公司。外周血淋巴细胞亚群使用 BD公司}imulset TM IMK一淋巴细胞亚群免疫荧光试剂盒。所用单克隆抗体组合为:FITC一抗CD45/PE - 抗CD14 ( A ) , FITC一IgG1/PE一IgG2a ( B ) , FITC一抗 CD3/PE一抗CD19 ( C ) , FITC一抗CD3/PE一抗CD4 ( D ) , FITC一抗CD3/PE一抗CD8(E) ,FITC一抗CD3/ PE一抗CD16十抗CD56 ( F。外周血淋巴细胞染色方案如下:A,B,C,D,E,F样品测定管中各加人50浏新鲜外周静脉抗凝血标本，依次加人上述荧光标记抗体各10州，振荡混匀，室温避光孵育20 min;加人1 ml 溶血素，振荡混匀，室温避光放置10 min ,1200 r/min 离心5 min，弃上清液，加人PBS 1 m1,1200 r/min离心 4 min，弃上清液，加人400闪PBS,混匀后上机检测，采用SimuISET软件获取分析。流式细胞仪设门策略参考作者以往报道LS」。

1.3统计分析使用SPSSll. 5软件统计分析原始数据。参考值范围采用中位数(2.5%,97.5%分位数)表示。各组之间的比较采用Mann一}} hitney" U检验，与年龄的相关性采用Spearman's等级相关检验。 P < 0. OS表示差异有统计学意义

2结果

2. 1健康人群、慢性丙型肝炎以及丙型肝炎肝硬化患者外周血淋巴细胞亚群与年龄的相关性分析分析健康人群和HCv感染慢性肝炎和肝硬化人群外周血淋巴细胞亚群频率与年龄的相关性。发现健康人群中，CD3十CD4十T细胞、CD3' CD16十CD56十NKT细胞频率以及CD4/CD8比值与年龄呈显著正相关(P< 0.05);而在慢性丙型肝炎人群中，CD3' CD4十T细胞与年龄呈显著正相关，CD3一CD19' B细胞则与年龄呈显著负相关(P <0.05);在肝硬化人群中，只有CD3 CD16十CD56十NK细胞频率与年龄呈显著正相关(尸< 0. OS)(表1)。

2. 2不同年龄段人群外周血淋巴细胞亚群与性别的相关性分析进一步分析不同年龄阶段人群外周血淋巴细胞亚群与性别的关系，发现15 } 49岁的健康男性CD3十T细胞和CD3' CD4十T细胞亚群频率均低于女性;而在该年龄段慢性丙型肝炎患者男性人群中，CD4/CD8比值和CD3+CD4+T细胞频率也低于女性。但上述T细胞亚群在肝硬化患者群体中却无显著性别差异，但CD3一CD19 } B细胞频率却在肝硬化男性患者中显著高于女性患者。类似的发现同样发生在50岁以上健康人及肝硬化人群中:女性人群 CD4/CD8比值显著高于男性，而CD3十CD8+T细胞频率却显著低于男性(P<0.05)(表2) o

2. 3不同年龄段人群琳巴细胞亚群与疾病进展的相关性分析比较不同年龄阶段丙型肝炎和肝硬化人群与健康人群间外周淋巴细胞亚群频率，发现:在3一14岁人群 中，与健康人相比，慢性肝炎人群CD3一CD16' CD56十 NK细胞亚群频率显著降低(P<0.}5)。在15一49岁人群中，与健康人相比，慢性肝炎及肝硬化患者外周血中CD3十T细胞、CD3 + CD4' T细胞、CD3 - CD8十T 细胞、CD3一CD19' B细胞亚群频率以及CD4/CD8比值均显著升高，而CD3一CD16十CD56十1} K细胞亚群频率则显著降低;并且慢性肝炎患者的CD3 + CD16十 CD56十N KT细胞亚群频率较健康人也显著降低。与慢性肝炎组比较，肝硬化患者CD3一CD19十B细胞亚群频率则显著升高(P<0.05)。在>49岁人群中，与健康人群比较，慢性肝炎及肝硬化患者外周血CD3十 CD4十T细胞,CD3一CD19' B细胞亚群频率均显著升高，而CD3一CD16' CD56 + }K细胞亚群频率则显著降低;肝硬化患者的CD3 + CD16' CD56十NKT细胞亚群频率也显著降低。与慢性肝炎比较，肝硬化患者中 CD3十CDR十T细胞、CD3一CD19' B细胞亚群频率均显著升高，CD3 + CD16十CD56' NKT细胞亚群频率显著降低(P<0. OS)(表3)。

3讨论 年龄是影响人体免疫状态的重要因素“，有文献报道重型肝炎中小儿外周血CDR' , CD3' CD4十及 CD3'CD}+T淋巴细胞数量明显高于成人a然而健康人外周血淋巴细胞亚群比例与年龄的相关性尚不明确。一些研究显示，C D4十T细胞数量随着年龄增加而增加工。一”」，而另一些研究则发现，CD3+CD4+T 细胞数量随着年龄增加而减少12一‘3。引起这些差异的原因可能与这些研究分析的人群年龄分布较窄有关。在本研究中，健康人年龄分布较广，其外周血 CD3 } CD4十T细胞和CD3 + CD16' CD56十NKT细胞频 率与年龄存在明显的正相关关系;这种正相关关系在慢性丙型肝炎患者中仍然存在二作者还发现，慢性肝炎人群中，CD3一CD19' B细胞频率与年龄呈显著负相关;而肝硬化患者中，CD3一CD16' CD56 + NK细胞频率则与年龄呈显著正相关。这些结果提示，HCV感染可能会打破机体淋巴细胞的分布平衡，但其具体临床意义尚不清楚。作者还发现，HCV感染不同疾病阶段(慢性肝炎和代偿期肝硬化)外周血淋巴细胞频率与性别关系密切。在15-49岁的健康人及慢性肝炎人群中，女性C D4十T细胞亚群频率高于男性;而在肝硬化患者中，女性CD3一CD19十B细胞频率低于男性。

目前，对引起这些差异的因素还不清楚，但越来越多的研究提示，病毒慢性感染疾病转归与性别的关系及机体免疫状态密切相关。例如，HIV感染的女性由于浆细胞样树突状细胞(pDC)活化显著高于男性，引起疾病进展更快‘4。临床已经发现，HBV和HCV感染后，男性患者疾病进展为肝癌较女性更多与白细胞介素(IL)一6分泌密切相关15。这些研究提示，性别或许可通过影响机体免疫状态而影响疾病进展。

作者还比较了不同年龄阶段慢性肝炎、代偿期肝硬化与健康人群外周血淋巴细胞亚群的分布差异发现在所有年龄的人群中，HCV感染患者的CD3一CD16 CD56' NK细胞亚群频率均较正常人显著降低，而 CD3'CD8'T细胞频率则显著升高。这与以往的研究类似‘7一。最近研究也提示，CD3一CD16+CD56+1V-K细胞减少可能导致CD3十CD8+T细胞持续增加。在鼠巨细胞病毒感染的研究中发现，CD3一CD16 + CD56 + NK细胞扮演了重要的地位，其活力的丧失可能会增加CD3' CD8十T细胞和CD3十CD4+T细胞的功能，这可能与病毒感染的抗原细胞持续刺激有关’6一。此外，作者还发现，在15岁以上人群，CD3一CD19' B细胞在健康人、慢性肝炎、肝硬化患者中有呈持续升高的现象，提示B细胞与肝纤维化关系密切。既往研究表明，B细胞可通过对肝组织的损伤与修复发挥作用而影响肝纤维化进展L1}7。这些结果提示HCV感染可改变人体淋巴细胞亚群分布，将来的研究应该明确这些变化的淋巴细胞亚群的临床意义及相关的机制。

总之，本研究通过回顾性分析健康人群和HCV 感染不同阶段患者淋巴细胞亚群的分布特点及其与 HCV疾病进展、年龄、性另」的关系，为临床科学评价丙型肝炎人群免疫状态提供重要的免疫指标。

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