HBV复制及不同基因表达不影响CDC37水平

原发性肝细胞癌(HCC)是最为常见的恶性肿瘤之一。在我国，乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起HCC高发病率的主要原因，但其致病机制仍不十分清楚。已有的调查发现，HBV DNA水平、HBV基因型、HBV X蛋白的反式激活、HBV基因组变异以及HBV基因在宿主染色体上的整合等均可能成为HCC发生的危险因素。近年来的研究发现多条细胞信号通路与HCC的发生密切相关，这些信号通路包括RAS/MAPK、PI3K/AKT、 Wnt/β-catenin等[1]，在这些信号通路中起关键作用的是一类称作蛋白激酶的分子，如ERBB2、CRAF、AKT等，而这几种蛋白激酶的成熟均需CDC37 分子的辅助。 CDC37作为热休克蛋白90(HSP90)的一种重要的辅助分子伴侣能够特异性地与蛋白激酶结合，防止新合成的蛋白激酶的错误折叠和降解[2]。研究发现，CDC37在活跃增殖的组织中的表达水平明显高于正常组织，而且 CDC37的过表达能够促进正常前列腺上皮细胞增殖[3]。我们及其他学者的研究发现CDC37在肝癌组织中的表达明显高于癌周组织和正常肝组织，肝癌细胞系中 CDC37基因表达的沉默会明显抑制其在裸鼠中肿瘤模型的形成和生长，在肝癌的形成过程中CDC37的高表达能够弱化P16对细胞生长的抑制[4-5]，提示CDC37表达的上调在HCC 发生过程具有重要作用。那么在 HBV感染所导致的HCC发生过程中，除病毒本身的作用因素外，HBV的复制或其基因的表达是否会上调 CDC37在肝组织中的表达，造成肝细胞内CDC37的持续高水平状态，进而诱发正常肝细胞的异常增生和癌变?这个问题的回答对于进一步明确HBV所致HCC 的机制具有重要意义。在对鸭乙肝病毒研究中发现 CDC37的过表达可促进鸭乙肝病毒的复制和包装，但目前尚未见有关HBV与CDC37相关性的报道。为此，本研究通过体外细胞系的研究来明确HBV的复制和不同基因的表达是否会影响细胞内CDC37的表达水平。

1 材料和方法

1.1 材料腺病毒重组包装系统、JM109 及所用肝癌细胞系 Huh7和HepG2 均为南方医科大学肝病中心实验室保存。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶及Taq 酶均为 TaKaRa公司产品;DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、基因组DNA提取试剂盒以及PCR产物回收试剂盒等均购自德国QIAGEN公司;荧光素酶报告质粒pGL3及检测试剂购自美国Promega公司;CDC37单克隆抗体购自美国Abcam公司;Western blot所用蛋白提取、定量以及发光检测均购自美国Pierce公司;液体 DMEM培养基、胎牛血清及转染试剂Lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司;HBsAg及HBeAg定量检测试剂购自美国雅培公司;引物合成及序列测定由广州英

1.2 方法

1.2.1 HBV不同基因的扩增和表达载体的构建以本室保存的HBV/C 全基因质粒为模板，分别设计引物 PCR扩增HBV的6个基因：P、preS1、preS2、S、C和X，扩增产物经PstⅠ和SalⅠ双酶切，琼脂糖凝胶回收后连接至pCMV表达载体的PstⅠ和SalⅠ位点，构建的重组表达载体经双酶切鉴定插入片段的大小，并进一步测序确定插入序列的正确性。

1.2.2 CDC37基因启动子序列荧光素酶报告质粒构建取外科手术切除的肝组织标本，用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒按照说明提取基因组DNA，同时根据GenBank 中上传的CDC37 启动子区序列(AY864824)设计上下游引物：37promoter up：5'-TCGAGGTACCGCTATGGGATGTAGCAGAAG- 3' (Kpn Ⅰ)和37promoter down：5'-TCACAGATCTCCCTGTGTGACGTCACATCC- 3(' BglⅡ)，在上下游引物中分别引入KpnⅠ和BglⅡ酶切位点。取3 μl提取的基因组 DNA，PCR法扩增CDC37基因的2 kb 启动子序列，产物用PCR产物回收试剂盒进行回收，再用KpnⅠ和Bgl Ⅱ内切酶37 ℃双酶切4 h，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收。提取荧光素酶报告质粒 pGL3，用KpnⅠ和BglⅡ内切酶37 ℃双酶切4 h，产物经琼脂糖凝胶回收，再与回收的CDC37启动子片段用T4 连接酶16 ℃连接反应6 h，转化感受态细菌JM109。随机挑取6个克隆培养后提取质粒，并用KpnⅠ和BglⅡ 双酶切筛选阳性克隆，最后将重组克隆进一步测序确定插入序列的正确性。

1.2.3 HBV不同基因对CDC37 表达的影响Western blot检测：首先用重组有不同HBV基因的pCMV质粒分别转染6孔板中的Huh7和HepG2细胞，转染3 d后收集细胞，用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白后进行定量，取30 μg用Western blot法检测细胞中CDC37的表达水平，分析HBV不同基因对CDC37表达的影响。荧光素酶检测：用重组的pCMV和pGL3质粒分别共转染 24孔板中的Huh7和HepG2细胞，用pRL-TK质粒作为内参平衡不同孔之间的转染效率，用pCMV空质粒作为对照，转染48 h后收集细胞，按试剂盒说明检测荧光素酶信号，分析HBV不同基因对CDC37的表达是否会产生影响。

1.2.4 HBV DNA 1.28拷贝全基因组构建及腺病毒包装 1.28拷贝HBV全基因组的构建及腺病毒包装参照本科室前期建立的方法进行[6]，共构建B、C、D和CD重组体4 种基因型毒株的1.28拷贝全基因质粒。从上述不同基因型慢性HBV感染者血清中扩增HBV全基因序列以及3个不同区段的序列，经多次克隆、测序以及片段连接，挑取仅含优势株序列的1.28拷贝HBV全基因克隆扩大培养，大量提取质粒并转染Huh7肝癌细胞系，转染 2 d 后化学发光半定量法对细胞上清中HBsAg 和 HBeAg表达情况进行检测，确定构建的HBV全基因毒株能够正常表达HBsAg和HBeAg。随后将具有复制活性的1.28拷贝HBV全基因组转化细菌Adeasier-1进行细菌内同源重组，并用PacⅠ酶切鉴定重组的克隆。最后用PacⅠ线性化重组腺病毒质粒，用脂质体法转染 293细胞进行重组腺病毒包装。

1.2.5 Western blot 检测HBV复制对CDC37 表达的影响按感染复数(MOI)为5~10的标准用包装的重组腺病毒分别感染6孔板中的Huh7和HepG2细胞。感染3 d 后收集细胞，提取细胞中的总蛋白，再对提取的蛋白进行定量，取30 μg进行Western blot检测，用包装的未插入外源基因的空pAdTrack做对照，比较不同HBV基因型毒株的复制对CDC37表达水平的影响。

2 结果

2.1 HBV不同基因对CDC37表达的影响以HBV/C全基因质粒为模板分别扩增了HBV的6 个基因P、preS1、preS2、S、C和X，并成功构建至表达载体pCMV的PstⅠ和SalⅠ位点，重组表达载体用PstⅠ 和SalⅠ进行双酶切，确定目的片段的插入(图1)，随后测序证实了目的片段序列的正确性。重组有HBV不同

2.2 HBV不同蛋白表达对CDC37启动子活性的影响为检测HBV 6 种不同蛋白的表达对CDC37 启动子活性的影响，分别将重组有HBV 6种不同基因的表达质粒pCMV与含CDC37启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL3共转染Huh7和HepG2细胞，转染48 h后裂解细胞，检测荧光素酶信号，结果(图3)显示HBV 6种不同蛋白的表达对CDC37启动子的活性无明显影响。

2.3 HBV复制对CDC37表达的影响为研究HBV复制过程中多种蛋白的共同表达及作用是否会影响CDC37的表达水平，本研究分别构建了流行于中国的B、C、D及CD重组体4种HBV基因型毒株的1.28拷贝可复制质粒，并用AdEasy腺病毒系统进行腺病毒重组和包装，然后分别感染Huh7和HepG2细胞，感染3 d后收集细胞，用Western blot检测不同HBV 基因型毒株的复制对CDC37表达的影响，结果(图4)未发现不同HBV基因型毒株的复制对CDC37基因的表达有明显影响。

3 讨论

近年来对于导致HCC发生的主要因素已经比较明确，但由于该病的治疗手段有限，发病机制复杂，因而患潍捷基公司完成。者的生存率多年来并未有明显提高。HBV是导致HCC 发生的主要因素，此外HBV感染引起机体的免疫攻击会造成肝细胞的坏死以及随后的肝细胞再生，这种反复的肝细胞坏死和再生的过程不但会导致端粒及端粒酶活性的改变，而且还可能造成肝细胞染色体的突变和与细胞增生有关的信号通路的激活，从而导致正常肝细胞的异常增生和癌变。CDC37是HSP90的一种重要的辅助分子伴侣，能够特异性地辅助多条信号通路中多种蛋白激酶的成熟。新合成的不稳定的蛋白激酶首先与 HSP70/HSP40结合，随后与CDC37结合，并在CDC37 的帮助下才能与HSP90 结合形成蛋白激酶-CDC37- HSP90复合物，并进一步使结构不稳定的蛋白激酶成熟为有活性的或随时可被激活的稳定结构[7-8]。一般认为，CDC37的表达维持下游激酶的水平，帮助激酶的活化与修饰，从而引起细胞增殖。我们前期的调查发现，CDC37在HBV相关HCC组织中的表达水平明显高于癌周组织，而且HCC组织中CDC37与ERK和 AKT的蛋白水平及激活状态密切相关。进一步实验发现，用CDC37抑制剂Celastrol抑制HCC细胞系HepG2 和Huh7 中CDC37 的表达导致ERK和AKT蛋白量的下降，提示CDC37 高表达对HCC至关重要。HBV与 HCC的发生密切相关，但其致癌机理仍有待阐明，从 CDC37与HCC发生的相关性方面，可考虑两方面原因，一方面，HBV在长期的慢性携带过程中可能由于机体有限的免疫反应并不能完全清除HBV，反而使肝细胞长期反复地出现坏死和再生的过程，肝细胞的不断再生使肝组织处于活跃的增殖状态，活跃增殖的肝细胞内 CDC37表达水平出现主动或被动上调，上调的CDC37 进一步促进ERK和AKT等蛋白激酶的合成和RAS/ MAPK、PI3K/AKT等信号通路的激活，这样持续的与肿瘤发生相关的信号通路的活化将最终导致肝细胞的异常增生和癌变;另一方面，HBV本身的持续复制和病毒蛋白的表达是否会上调CDC37的表达，从而通过激活相关信号通路而增加HCC的发生率?为明确HBV 的复制及蛋白表达与CDC37表达水平的相关性，我们首先研究了HBV 6 种蛋白的表达与CDC37 水平的相关性，结果发现HBV不同蛋白的表达既不影响CDC37 蛋白的表达水平，也未对CDC37启动子的活性有明显影响。随后我们又分别构建了4种HBV基因型毒株的 1.28 拷贝可复制质粒并感染肝癌细胞系，结果发现 HBV的复制对CDC37表达水平也无明显影响。这些结果提示HBV的复制和不同蛋白的表达不会通过上调肝细胞内CDC37的表达水平而导致HCC的发生，肝细胞的反复坏死和再生过程中CDC37表达水平的上调可能对于HCC的发生作用更明显。作为蛋白激酶特异性的辅助分子伴侣CDC37在肿瘤细胞的生长、分裂、分化过程中起着关键作用，因此也成为近年来抗肿瘤药物研究的热点，针对CDC37及其复合物的抑制剂研究也在不断进展中[9]，这些抑制剂将可能从多条信号通路，多个渠道来抑制肿瘤细胞的生长，从而达到延缓肿瘤进展或治疗肿瘤的目的。由于 HCC的治疗手段非常有限，治愈率不高，患者术后5年生存率低，如果我们能够明确CDC37在HCC的发生发展过程中所起的促进作用，那么在慢性肝病向HCC进展过程中及时抑制CDC37及其复合物的活性，进行早期干预，提高患者的生存率和生存质量。本研究结果提示HBV本身不会上调CDC37的表达，但在对鸭乙肝病毒的研究中发现，鸭乙肝病毒的逆转录酶需要CDC37 辅助，CDC37的过表达可促进鸭乙肝病毒的复制和包装，而C末端缺失的突变体CDC37则会抑制鸭乙肝病毒的复制[10]，但CDC37的高表达是否会如同鸭乙肝病毒一样促进HBV的复制目前还不清楚，有待做进一步的研究。如果CDC37的过表达能促进HBV的复制，那么在HCC的发生过程中CDC37不但可能从激活信号通路的角度诱发正常肝细胞癌变，而且从提高HBV复制水平的角度增加HCC发生的风险。

参考文献：

[1] Villanueva A, Newell P, Chiang DY, et al. Genomics and signaling pathways in hepatocellular carcinoma[J]. Semin Liver Dis, 2007, 27 (1): 55-76.

[2] Taipale M, Krykbaeva I, Koeva M, et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition [J]. Cell, 2012, 150(5): 987-1001.

[3] Schwarze SR, Fu VX, Jarrard DF. Cdc37 enhances proliferation and is necessary for normal human prostate epithelial cell survival[J]. Cancer Res, 2003, 63(15): 4614-9.

[4]Pascale RM, Simile MM, Calvisi DF, et al. Role of HSP90, CDC37, and CRM1 as modulators of P16(INK4A) activity in rat liver carcinogenesis and human liver Cancer[J]. Hepatology, 2005, 42 (6): 1310-9.

[5]Wang ZH, Wei W, Sun KW, et al. Molecular effects of suppressing the CDC37 cochaperone in hepatocellular carcinoma inhibits cell cycle progression and cell growth[J]. J Hepatol, 2012, 56: S130.

[6] 周彬, 梁敏锋, 李伟东, 等. 应用腺病毒载体系统将HBV/C全基因组转导入HepG2细胞的方法学研究[J]. 南方医科大学学报, 2008, 28 (10): 1764-7.

[7] Gray PJ, Prince T, Cheng J, et al. Targeting the oncogene and kinome chaperone CDC37[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(7): 491-5.

[8] Smith JR, Workman P. Targeting CDC37: an alternative, kinasedirected strategy for disruption of oncogenic chaperoning[J]. Cell Cycle, 2009, 8(3): 362-72.

[9] Wu F, Peacock SO, Rao S, et al. Novel interaction between the co-chaperone Cdc37 and Rho GTPase exchange factor Vav3 promotes androgen receptor activity and prostate Cancer growth[J]. J Biol Chem, 2013, 288(8): 5463-74. [10]Wang X, Grammatikakis N, Hu J. Role of p50/CDC37 in hepadnavirus assembly and replication[J]. J Biol Chem, 2002, 277(27): 24361-7.