艾滋病合并侵袭性真菌感染早期检测的研究进展

侵袭性真菌感染是艾滋病感染者(HIV)/艾滋病患者(AIDS)中最常见的机会感染，也是感染艾滋病患者就诊和死亡的主要原因之一。艾滋病合并侵袭性真菌感染发病隐匿、临床表现不典型、治疗手段有限、病死率与致残率高，早期、特异的诊断对于改善预后意义重大。以培养、病理方法诊断侵袭性真菌感染仍然是金标准但是有一定的局限性。近年来，以隐球菌乳胶凝集试验等为代表的早期血清学诊断方法值得在临床大力推广，而应用分子生物学技术检测侵袭性真菌感染以检出率高和特异度好为特点也使其成为研究热点。这些技术也迅速被应用于艾滋病合并侵袭性真菌感染的早期检测，本文就近年来国内外该领域的研究作一综述。

1　艾滋病合并侵袭性真菌感染的研究进展侵袭性真菌是指能侵袭深部组织和内脏及全身的真菌，主要有假丝酵母菌、隐球菌、曲菌、毛菌、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌等，组织胞浆菌为二相性真菌，假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌和卡氏肺孢菌等为条件致病性真菌，只有在一定的条件下才引起机体致病[1]。侵袭性真菌感染(IFIs)系指病原真菌侵犯心、肝、脾、肺、肾、脑、血液等各系统内脏器官而引起的系统感染性疾病。从全球范围看，侵袭性真菌感染的发病率及死亡率明显上升，这与老年人口、艾滋病患者等易感人群增加，造血干细胞移植与器官移植的广泛开展、各种侵入性医疗技术应用、广谱抗菌药物及免疫抑制剂的使用等有密切关系[2]。另外，研究显示侵袭性真菌感染的基础疾病主要有HIV 感染(47.4%)、恶性肿瘤(14.7%)、糖尿病(9.9%)、慢性肺部疾病(9.3%)等，艾滋病感染又居所有真菌感染基础疾病的首位。研究发现在我国住院艾滋病患者中，侵袭性真菌感染的发生率为41.2%，侵袭性真菌感染的病死率高达22.9%[3]。由于侵袭性真菌病具有发病隐匿、临床表现不典型、治疗手段有限、病死率与致残率高的特点，早期、特异的诊断对于改善预后意义重大。HIV 感染主要导致患者细胞免疫功能异常，临床上主要表现为因免疫功能低下而发生的一系列机会性感染和肿瘤。机会性感染是晚期AIDS患者就诊、入院、致死的最重要原因，而机会感染中侵袭性真菌感染又占有相当高的比例[4]。随着艾滋病疫情的蔓延，侵袭性真菌感染的患者日益增多，引起侵袭性真菌感染的真菌几乎包含了所有已发现的致病性真菌和某些条件致病性真菌，临床上以念珠菌、曲霉菌、隐球菌等真菌比较多见，侵袭性真菌感染发生部位以肺、脑等内脏器官和深部组织为主，侵袭性真菌感染对艾滋病患者的危害性极大，这类患者的病死率极高[5]。国外报道AIDS侵袭性真菌感染常见感染真菌为念珠菌、曲霉菌和隐球菌。念珠菌是真菌感染中最重要的致病菌之一，有研究报道白色念珠菌感染在AIDS真菌感染率最高。曲霉菌感染中又以烟曲霉菌感染为主。近年来，隐球菌感染发病率越来越高，在国外已成为AIDS最常见的并发症之一[6]。粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌和马尔尼菲青霉菌等真菌感染均是常见的HIV 相关疾病。粗球孢子菌病主要流行于美国西部、墨西哥北部及南美洲部分地区，我国也有病例报道。马尔尼菲青霉菌是青霉菌属中唯一温度双相性真菌，在东南亚(尤其是泰国北部)及中国南部流行。曾常红等[7]报道的71 例HIV/AIDS患者中，真菌感染率为53.5%，致病菌以白色念珠菌为主，占72.8%，其次为马尔尼菲青霉，占20.6%。

2　CD4+ T 淋巴细胞计数与AIDS患者中侵袭性真菌感染率的关系CD4+T 淋巴细胞能直接反映AIDS 患者的免疫功能状态，能帮助预测患者可能出现机会性感染，并予以提前预防的可能性。经过多年研究发现，外周血CD4+ T 淋巴细胞小于200×106/L 时，预示着机体即将发展成AIDS。并且CD4+ 在不同水平时，机会性感染种类、出现的时间和频率均不一样[8]。据报道，当CD4+T 淋巴细胞计数小于200×106/L，真菌感染率达71.05%;而CD4+T 淋巴细胞计数大于200×106/L 时，感染率为33.33%，可见CD4+T 淋巴细胞计数越低，真菌感染可能性越大。HIV 感染者CD4+ T 淋巴细胞计数小于200× 106/L 时易发生念珠菌感染，而当CD4+ T 淋巴细胞计数小于100×106/L 时易感染曲霉菌。播散型组织胞浆菌及球孢子菌病主要发生于CD4+ T 淋巴细胞计数小于50×106/L 的患者中，CD4+T 淋巴细胞计数小于50×106/L 时也应注意马尔尼菲青霉菌感染[9]。陈媛媛等[10]研究表明CD4+ T 淋巴细胞计数小于或等于50×106/L 的患者血清隐球菌抗原阳性率为72.73%，CD4+T 淋巴细胞计数越低HIV/AIDS 患者血清隐球菌抗原阳性率越高。最新研究报道艾滋病合并念珠菌食管炎的食管受累范围及程度与患者外周血CD4+ T 淋巴细胞计数具有相关性，即随着CD4+ T 淋巴细胞计数水平的降低，受累食管由下向上进展，程度也进一步加重[11]。

3　侵袭性真菌感染早期检测的研究进展侵袭性真菌感染的早期诊断及能在早期给予恰当的治疗成为目前临床真菌诊断与治疗最迫切的问题。组织病理学检查和病原真菌培养，仍然是IFIs诊断的金标准。然而要获得病原真菌和组织病理学阳性标本在临床上仍然是非常困难的。大量的研究表明基于真菌细胞壁特异性成分的血清学检测或其他体液的检测，已经应用于恶性血液病或造血干细胞移植合并侵袭性真菌感染的患者，并获得了良好的诊断价值评价。其中1，3βD葡聚糖(1，3βDglucan，BDG)，半乳甘露聚糖(GM)的诊断价值已经得到了公认[12]。1，3βD葡聚糖检测即G 试验。到目前为止，G 试验的血清BDG 浓度阈值主要来源于以下患者检测值：(1)最主要是急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤;(2)疑似内源性真菌性眼内炎、重症外科患者、中暑患者;(3)农民肺、肺曲霉菌病、卡氏肺孢子虫肺炎以及其他的确诊或拟诊有侵袭性真菌感染的患者。当患者血清BDG 浓度大于20pg/mL 就可以拟诊为侵袭性真菌感染。尽管在侵袭性真菌感染患者的血液中可以检测到BDG，但是其对机体的影响仍不清楚[13]。在确诊侵袭性曲霉菌感染(IA)的患者中，5d内血清BDG 浓度明显升高，因此根据体内抗原释放的动力学规律每周做两次G 试验检测对于IFIs早期诊断是必要的。研究表明，在确诊或拟诊IA 患者中G 试验升高要比高分辨率CT 的影像学改变平均提前9.3d。最近有研究报道，血液肿瘤合并侵袭性真菌感染患者中血清BDG 水平变化与患者对抗真菌治疗如两性霉素B和卡泊芬净的反应有关。对IA 患者血清中BDG 抗原水平监测表明，血清BDG 随抗真菌治疗转归而下降，而在耐药患者中则表现为BDG 持续高水平[14]。张晓艳等[15]最近对G 试验在儿童侵袭性真菌感染中的诊断价值进行了评价，G 试验诊断IFIs的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72.1%、86.4%、39.2%和96.2%。而黄素钦等[16]认为G 试验是诊断AIDS患者真菌感染的有效辅助手段。半乳甘露聚糖检测亦称GM 试验。血清GM 抗原水平对诊断IFIs具有重要意义[17]。GM 是具有强免疫原性的抗原，存在于烟曲霉菌或其他的曲霉菌属。GM 是一种细胞壁多糖物质，相对分子质量约35×103～100×103，随着真菌在组织中生长而释放入血。GM 可以通过特异性结合半乳甘露聚糖的鼠单克隆抗体EBA2检测。曲霉菌在体外可以释放相对分子质量约为20×103 的多糖，但GM 的抗原表位随不同种类的曲霉菌而不同。根据欧洲和美国的IFIs诊断标准推荐，应用酶联免疫吸附测定法检测GM 抗原OD≥0.5为阳性标本，而小于0.5为阴性标本。同时要求发现阳性标本必须重新抽血检测且OD≥0.5才能拟诊曲霉菌感染，以排除污染。一些学者提出，在根据临床表现和影像学资料疑似IFIs的患者且合并中性粒细胞减少症，可能需要1 周至少2 次甚至每天检测GM，以排除一过性的升高。对于那些真菌感染高风险的患者如：中性粒细胞减少症、移植物抗宿主、长期使用类固醇激素药物的患者等，至少每周两次GM 试验是必要的[18]。王彦艳等[19]对中性粒细胞绝对值小于0.5×109/L 的血液病患者研究显示，单次GM 值大于或等于1.0 时，其敏感度为66%，特异度为80%，连续2次GM 值大于或等于1.0时，其敏感度为73%，特异度为93%，连续2次血清GM 值对侵袭性曲霉菌感染具有更大的参考价值。当然GM 试验需要结合其他的检测方法如高分辨率CT 才能更准确的诊断侵袭性真菌感染。以聚合酶链反应(PCR)为基础的分子生物学检测方法，为真菌检测提供了一种更快，敏感度更高，特异度更好的真菌检测方法。初步的研究表明，基于PCR 的真菌检测可以指导IFIs的治疗，减少一些不必要的抗真菌治疗降低了治疗费用和毒副作用。此外，最新的PCR 技术可以检测抗真菌耐药基因位点，然而这些位点与临床抗真菌治疗耐药的关系还有待进一步研究。总之，经过PCR 真菌检测技术的标准化，以及大规模的前瞻性研究验证，才能更好的推广应用该技术[20]。然而，PCR 反应中非真菌DNA 污染是限制该技术广泛应用的重要原因，如使用非无菌样本或非特异性引物。自动化DNA 提取和纯化试剂盒都可能含有少量DNA 污染物。而且区分所扩增的DNA 是来源于侵袭性真菌还是真菌菌体成分污染比较困难，如检测曲霉菌需要扩增侵袭性曲霉菌的DNA 而不是曲霉菌扩散的分生孢子。此外，标本类型也会影响PCR 真菌检测的敏感度，在检测侵袭性念珠菌感染(IC)中全血标本优于血清，然而在检测IA 时全血与血清有同样的敏感度。可能原因是念珠菌菌体细胞是可被中性粒细胞吞噬，而曲霉菌菌丝太大需要以细胞外方式清除，因此全血的中性粒细胞包含了更多的念珠菌DNA[21]。侧流免疫层析检测方法(LFD)，即胶体金免疫层析试纸条检测法是目前最新的一种简便、特异、迅速检测侵袭性曲霉菌方法。该方法是利用包被有鼠单克隆抗体JF5的胶体金免疫层析试纸条特异性结合N 端糖基化的糖蛋白抗原，该抗原存在于侵袭性曲霉菌菌丝细胞壁和隔膜上或由菌丝末端不断分泌[22]。相对于GM 试验中使用的抗半乳甘露聚糖单克隆抗体EBA2可以与青霉菌或拟青霉菌属发生交叉反应，单克隆抗体JF5与宛氏青霉的交叉反应显得非常弱，而与在人际传播常见的马尔尼菲青霉菌几乎没有交叉反应。White等[23]最近也比较了实时PCR、GM 试验及侧流免疫层析3种方法检测侵袭性曲霉菌的应用价值，LFD 的检测特异度达98.0% 和实时PCR 的96.6%差不多，而比GM 试验91.5% 要高;其敏感度为81.8%虽然低于实时PCR95.5%，但明显优于GM 试验的77.3%。而当LFD 与实时PCR 结合应用时，特异度与敏感度均达100%。

4　小　　结

总之，侵袭性真菌感染是艾滋病患者中常见的机会感染，早期、特异诊断艾滋病合并侵袭性真菌感染对于提高AIDS患者的生存时间和生存质量具有十分重要的意义。快速真菌抗原血清学检测应用于筛查恶性血液病合并侵袭性真菌感染的价值已得到证实。然而GM 试验等诊断阈值标准尚存争论，检测的非特异性也是令人困恼的问题，因此，这些方法在艾滋病合并侵袭性真菌感染早期检测中的应用价值仍需要进一步探讨。

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(收稿日期：20131117)