HCV-cAg检测在丙型肝炎早期诊断中的应用价值

肝炎一直是我们国家传染病防治的重大课题，尽管当下仍以乙型肝炎的感染最为突出，但是，丙型肝炎的防治形势也依然严峻。作为可进展为肝癌的一种肝炎形式，今后很长的一段时间内，丙型肝炎仍是我国病毒性肝炎防治的一个重要课题。丙型肝炎是严重危害人类身体健康的一类传染病，与乙型肝炎一样主要通过血液传播。我国平均感染率为3.2%。北方地区稍高，约为4.6%，南方地区为2.6%～2.9%，感染人数估计有3700万。受感染的母亲传播给婴儿的发生率为5%。患急性肝炎后，约有50%～70%的感染者有转为慢性肝炎的倾向，重者20～25年后可转化为肝硬化，肝硬化患者10年内有大约30%发展为终末期肝病[1-2]。20世纪90年代以来，临床上诊断HCV感染主要利用基因工程表达HCV抗原构成的ELISA法来测定抗HCV抗体，但由于HCV感染患者体内抗HCV抗体的产生需一定的时间周期，此时间在普通人最长可至2个月(即常说的窗口期)，免疫缺陷患者则可高达12个月[3]，此间，HCV病毒可大量存在于病毒携带者的外周血中而不被查觉，因此，处在窗口期的HCV患者是目前输血性肝炎传播的一个重要来源[4]。虽然，一些分子生物学技术如RT-PCR、bDNA-PCR能有效地将HCV携带者的窗口期缩短至15～20d[5]，然而，上述技术存在着操作复杂、对人员及设备要求高及费用昂贵等问题[6]，在现阶段，PCR不适用于HCV普查，因此，当前急需一种，简单快捷、费用低、具有高度敏感及特异性的方法用于HCV的血源筛查。

1　资料与方法

1.1　样本：新鲜待检血清或血浆1ml，标本无溶血、无脂血、无微生物污染;标本采集应使用清洁、无菌的一次性干燥管。标本用量最少200μl，7d内检测的标本应在2～8℃保存，-20℃可保存2w，避免反复冻融血清。

1.2　试剂：HCV微板孔，HCV酶标记，抗体HCV，抗体阴性对照，HCV阳性对照，HCV样品稀释液，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液(2MH2SO4)[英科新创(厦门)科技有限公司提供]，抗HCV-CAg单克隆抗体包被酶标板，HCV-Ag阳性对照，HCV-Ag阴性对照，HCV-Ag样品稀释液，抗HCV-Ag酶结合物，显色剂A，显色剂B，终止液，洗涤液(20×浓缩)不干胶封片(由湖南景达基因有限公司提供)

1.3　方法

1.3.1　采用间接ELASA方法检测血清或血浆中丙型肝炎病毒抗体，在微孔条预包被基因表达HCV抗原，与血清中抗HCV抗体反应，再加入HRP标记羊抗人-IgG的酶标记的抗体与之结合，然后用TMB作用显色[7]。按如下操作：①将试剂从冰箱中取出并室温下平衡30min。将20×浓缩洗涤液用蒸馏水作20倍稀释。所用试剂使用前应充分混匀，不同的试剂瓶盖、不同批号的试剂不能混用。②按标本数量选择板条，同时预留阴性对照孔2个，阳性对照孔1孔，质控1孔。③先在反应孔中均加入100μl待测样本、阴性对照、阳性对照、外部阳性质控品，充分混匀，并避免产生气泡。④用封板膜封板后，置37℃加减1℃温育25min。⑤温育后，将封板膜揭掉，甩掉孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡60s，最后一次洗板务必完全移去包被中的残留液体，并避免产生气泡。⑥每孔中先后滴加100μl酶标抗体，并避免产生气泡。⑦用封板膜封板后，置37℃加减1℃温育25min。⑧温育后，将封板膜揭掉，甩掉孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡60s，最后一次洗板务必完全移去包被孔中的残留液体，并避免气泡产生。⑨每孔中先后加入底物A、B各50μl，轻微混匀。⑩用封板膜封板后，置37℃加减1℃水浴箱中温育10min。瑏瑡每孔中依次加入终止液50μl，轻微混匀，30min内上酶标仪显色。

1.3.2　设定酶标仪波长于双波长450/630nm检测，测定各孔OD值。

1.3.3　用2株抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体包被酶标板、另2株单克隆抗体标记HRP，并配以其他试剂组成，应用双抗体夹心酶联免疫法原理检测人血清样品中的丙型肝炎病毒核心抗原[8-9]。操作如下：①从冷藏环境中取出的试剂盒及样品，应用于室温平衡30min。所有试剂使用前应摇匀;浓缩洗涤液用蒸馏水作20倍稀释，注意瓶内不得残留结晶;②样品预处理：向预处理反应板中每孔各加入50μl预处理液，取待测血清或血浆样品各100μl加入相应孔中，混匀，56℃震荡孵育30min;③酶结合物工作液的配置：检测前，取出试剂盒装有酶结合物原液的小离心管，可稍作离心使液体集中于管底;根据每次检测用量现用现配。配制方法：取酶结合物原液，按检测用量，以1∶500的稀释比用试剂盒中的抗HCV-Ag酶结合物稀释至工作浓度，混匀;④检测均需设置空白、阴性、阳性对照各1孔。空白对照加入200μl样品稀释液，其他各孔先加入100μl样品稀释液，阴性对照每孔加入100μl阴性对照，阳性对照每孔加入100μl，其余各孔加入100μl待测样品(即预处理好的样本100μl)。混匀后用不干胶封片封盖反应板，37℃振荡孵育60min;⑤小心弃去孔内液体，拍干，用洗涤液6次，然后在吸水纸上拍干;⑥每孔中加入200μl酶结合物，用不干胶封片封盖反应板，37℃孵育30min;⑦弃去孔内液体，拍干，用洗涤液洗板6次，然后在吸水纸上拍干;⑧每孔中加入显色剂A、B各100μl，混匀后置37℃ 避光显色10min;⑨每孔中加入50μl终止液反应终止10min内以酶标仪450nm波长测定各孔OD值。注意事项：HCV-cAg实验前做好标本的预处理，是提示检测阳性率的重要步骤。见表1。　　

用丙型肝炎抗体检测结果作为参照，对比同一批标本中丙型肝炎病毒核心抗原检测的结果，以说明丙型肝炎核心抗原检测在临床早期检测丙肝的价值[10]。

表1　酶结合物工作液配制过程

稀释比例

对应检测样品数(人份)  酶结合物工作液使用量(ml)    酶结合物原液量(μl)1∶500

24    5     10  

48    10    20  

72    15    30  

96    20    400

2　结果　　

待检测的254例样本分别作HCV-cAg检测与HCV-Ab检测得出的结果。见表2。

表2　样本作HCV-CAg和HCV-A6检测结果(例)

分类 HCV-Ab(+)   HCV-Ab(-)

总计 HCV-cAg(+)   58     3      61

     HCV-cAg(-)   15   178     193

总计              73   181     254　　

计算得出HCV-cAg方法检测的灵敏度为79.5%，特异性为98.3%，方法准确性为92.1%。

3　讨论　　

ELISA法是目前检测HCV抗体或抗原最常规的办法。它的优点就是敏感性高(灵敏度达到10-9～10-12g)。特异性强，操作简便，易于观察(肉眼)，便于大规模检查以及适用于现场及基层。它具有荧光抗体(FA)、放射免疫法(RIA)的许多优点，但又避免了许多缺点。因而，国际上对ELISA法技术评价很高，它是近代血清学上革命性的新成就[11]。这也便是本次实验选择用ELISA法检测血清中丙型肝炎抗体作为参照方法的一个原因，两者同为ELISA方法，原理相近，因而，在一定程度上更具可比性，并且用ELISA法检测丙型肝炎抗体的方法临床应用时间较久，在其试剂开发方面也积累了很多好的经验，较为成熟，能够生产出高特异性与高敏感性的试剂，据相关报道，现在这类试剂已经更新到第三代，该试剂是用中国北方地区HCV全基因序列，根据文献开发的预测蛋白理化性质及三级结构和抗原决定簇的位点的序列软件，完成了HCV全基因序列的亲水性、亲近性、移动性分析，已预测到HCV抗原决定簇的位点。第三代试剂的特异性达到了99%[12]，抗-HCV检测可成为丙型肝炎病毒早期感染的检测指标。　　

现在比较常用来作为丙型肝炎检测的参照方法一般都是用逆转录聚合酶链反应，也就是我们常说的RT-PCR，因为其检测的对象是HCV-RNA，HCV-RNA反映病毒的复制与传染性，为病毒血症的标志，是诊断HCV的金标准。同时，逆转录聚合酶链反应具有相当多的优点，不仅具有很高的灵敏度和特异性，而且对于HCV的早期诊断、治疗期间抗病毒药物的疗效评价具有较高的实用价值。本实验之所以没有采用PCR法作为参照方法，是由于笔者所要验证的是HCV核心抗原检测ELISA法在临床中的应用价值，其与同为用ELISA法检测血清中抗-HCV更具有方法学上的可比性，同时，PCR法需要昂贵精密的仪器，昂贵的试剂以及容易交叉污染假阳性高，这也是本实验不采取PCR法作为验证试验的另外一层原因，还有就是ELISA法检测抗-HCV临床上运用时间较久，方法较为成熟，能基本上反映人体感染HCV病毒的情况，可以满足本次实验的需要。　　

本次实验中应注意HCV-cAg，要做好实验前的预处理，这是提交实验阳性率的重要步骤。实验结果HCV-cAg检测的特异性为98.3%，准确性为92.1%。故而，在不具备RNA检测条件的地方医院和实验室，用HCV-cAg检测替代，能较好地起到筛查作用。实验中灵敏度为79.5%，它较低可能是由于血清中有抗体的存在，干扰抗原的检测，HCV抗体与用于核心抗原检测的单克隆抗体竞争性结合，造成了HCV-cAg检测假阴性出现。

4　参考文献

[1]　straderDB，WrightT，ThomasDL，etal.Diagnosis，management，andtreatmentofhepatitisC[J].Hepatology，2004，39(4)：1147.

[2]　周永兴.慢性丙型肝炎的临床诊断及相关问题[J].世界华人消化杂志，2004，12(10)：2369.

[3]　VanderPoelCL，CuypersHT，ReesinkHW.HepatitisCvirussixyearson[J].Lancet，1994，344(8935)：1475.

[4]　SchreiberGB，BuschMP，KleinmanSH，etal.Theriskoftrasfusion-trasmittedviralinfections.TheRetrovirusEpidemiologyDonorStudy[J].NEnglJMed，1996，334(26)：1685.[5]　Müller-BreitkreutzK，BaylisSA，AllainJ.Nucleicacidamplificationtestsforthedetectionofblood-borneviruses.5thEPFA/NIBSCWork-shop，Amsterdam1998[J].VoxSang，1999，76(3)：194.

[6]　PoljakM，SemeK，KorenS.EvaluationoftheautomatedCOBASAMPLICORhepatitisCvirusPCRsystem[J].JClinMicrobiol，1997，35(11)：2983.

[7]　刘朋来，杜菊仙，沈新华.ELISA检测是抗-HCV灰带区血样的处理[J].中国输血杂志，2003，16(1)：25.

[8]　许　斌，韩光宇，程　梅.血液HBsAg、抗-HCV复检中应采用不同试剂和设置低限灰区[J].临床检验杂志，1998，16(6)：340.

[9]　金　奇.医学分子生物学[M].北京：科学出版社，2001：348.

[10]　张海文.丙型病毒性肝炎的临床诊断与治疗[J].中国现代药物应用，2007，1(5)：37.

[11]　杜　平.医用实验病毒学[M].北京：人民军医出版社，1985：166.

[12]　邢文革，郑怀竞.中华肝病病毒杂志[J].，2004，12(3)：170.

[收稿日期：2013-09-01　编校：陈伟/郑英善]