5-氮杂胞苷对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中Dickkopf同源序列3基因去甲基化的转录调节作用

甲状腺癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其发生发展是一个多步骤、多阶段相互作用的结果，研究表明，抑癌基因启动子区胞嚓咤一磷酸一鸟嘿吟基序(CpG)岛高甲基化使基因沉默、转录抑制，从而使其表达失活，是导致甲状腺癌的机制之一〔i-s7。人类Dickkopf同源序列3(DKK3)基因是经典Wnt信号传导通路的拮抗因子川，是1个抑癌基因，在人类多种实体瘤中发现存在DKK3启动子区的异常甲基化。5一氮杂胞着(5-azaC)是一种甲基化抑制剂，在DNA复制过程中可与甲基转移酶结合成共价复合物，使由于甲基化而失活的抑癌基因重新表达，恢复功能，从而抑制肿瘤细胞生长。我们采用鹰哇蓝(MTT)、逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)以及甲基化特异性PCR(MSP)方法检测经5-azaC处理后，甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1生长增殖、DKK3基因mRNA表达及启动子区甲基化状态，观察5-azaC对TPC-1细胞的影响及其对DKK3基因的调控。　　材料和方法　　1.材料:TPC-1细胞株(上海瑞金医院叶蕾博士惠赠);RPMI1640培养液(Hyclone公司);5-azaC(美国Sigma公司);PCRMix(北京百泰克公司);RT-PCR试剂盒(加拿大Fermentas公司);Trizol(美国Invitrogen公司);Taq酶,dNTP和引物合成(大连宝生物技术有限公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青公司);EZDNAMethylation-Gold试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)。　　2.MTT检测细胞生长抑制率:用含10%FBS的RPMI1640培养基培养TPC-1细胞。将对数增长期的TPC-1细胞以每孔8x10'一10x10'/L接种于96孔培养板中，24h后弃去上清液，加人含5-azaC浓度分别为2,5,10,20,50,100,200,400N,mol/L的培养液，每种浓度接种5孔，置于培养箱继续培养，分别于24,48,72h后每孔加人MTT溶液20},1(5留L),37℃继续培养4h，终止培养。阴性对照组不加5-azaC。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加人150闪二甲基亚矾(DMSO)，振荡、比色，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，求其平均值。细胞生长的抑制率(%)=(A对照组一A实验组)/A对照组x100%。实验重复3次。　　3.RT-PCR检测用药后DKK3mRNA的表达:取对数生长期的TPC-1细胞分别接种于6孔板中，细胞接种24h后，根据MTT实验结果选用4种有代表性浓度5,10,20,50N,mol/L5-azaC干预处理，作用48h后分别收集细胞，Trizol提取总RNA。以2闪总RNA作为模板，按试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。然后进行PCR扩增，反应体系:cDNA1}.t,l,PCRmix9.5,1,上下游引物各1闪，双蒸水补足25闪。DKK3引物序歹」:上游5’-ACAGCCACAGCCTGGTGTA-3’和下游5’-CCTCCATGAAGCTGCCAAC-3’o}，产物长度120by;内参甘油醛-3一磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列:上游5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’和下游5'-GA-CAAGCTTCCCGTTGTCAG-3'}6}，产物长度185by。反应条件为:首先95℃预变性5min后，94℃变性30s,66℃退火30s,72℃延伸30s，共29个循环，最后72℃延伸5min，至4℃完成反应。2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析，然后用Quantityone软件分析各条带的A值，以GAPDH为内参照，DKK3mRNA的相对表达水平为DKK3与GAPDH的A值之比。‘4.MSP检测用药后DKK3基因启动子区的甲基化状态:取对数生长期的TPC-1细胞分别接种于6孔板中，细胞接种24h后，根据MTT'实验结果选用4种有代表性浓度5,10,20,50}..t,mol/L5-azaC干预处理，作用48h后分别收集细胞，提取基因组DNA，亚硫酸氢钠修饰，应用ZYMO公司的甲基化试剂盒纯化DNA，以修饰后的DNA作为模板进行PCR扩增。甲基化特异性引物:上游5’-GGGCGGGCGGCGGGGC-3’，下游5’-ACAT-CTCCGCTCTACGCCCG-3';未甲基化引物:_L游5'-TTAGGGGTGGGTGGTGGGGT-3’，下游5’-CTACATCTC-CACTCTACACCCA-3。甲基化扩增产物长度为120帅，非甲基化扩增产物长度为126byoPCR反应体系为:TaIkaRaTackHS(5U/}.t,l)0.25N.,1,10xPCR缓冲液(Mg-一Plus)5p.,1,dNTPMixture(各2.5mmol/L)4p,1，上游(20p,mol/L)和下游(20p.,mol/L)各0.5p,1，甲基化修饰DNA1.s闪，去离子水补齐至50闪。反应条件:9s0C预变性stnin，然后94℃变性30s,60℃退火305,72℃延伸30s,35个循环后，72℃延伸5min,4℃时结束反应。以同样方法将上述甲基化引物替换为未甲基化引物，退火温度改为58℃进行PCR扩增。2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，凝胶成像分析，紫外灯下观察并照相。　　5.统计学方法:数据用均数士标准差(无士、)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，应用SPSS10.0统计软件分析。　　结果　　1.5-azaC对TPC-1细胞增殖的影响:经MTT检测可见，5-azaC对TPC-I细胞株增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性，同一时间不同药物浓度组之间的细胞生长抑制率差异有统计学意义(P<0.05);同一药物浓度不同作用时间组的细胞生长抑制率差异有统计学意义(P<0.05，表1);在一定范围内随药物剂量的增加和作用时间的延长，5-azaC对TPC-1细胞增殖的抑制作用越明显(图1)。　　2.TPC-1细胞经不同浓度5-azaC处理后DKK3mRNA的表达:经5,10,20,50N.,mol/L的5-azaC处理后，DKK3mRNA表达逐渐增强，相对表达量依次为0.208士0.017,0.365士0.013,0.489士0.017,0.s82士0.011，表达强度与5-azaC浓度呈剂量依赖关系(F=370.356,P<0.01)。　　3.不同浓度5-azaC处理后DKK3基因启动子甲基化状态改变:5,10,20,50}d,mol/L不同浓度5-azaC处理后，随着药物浓度的升高，去甲基化逐渐增强，而甲基化逐渐减弱，DKK3基因启动子高甲基化被去甲基化。　　讨论　　研究表明，癌基因的激活或抑癌基因的失活是恶性肿瘤发生的分子基础。DNA甲基化是引起抑癌基因失活的主要方式之一，是由S一腺昔甲硫氨酸作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶的催化作用下，在胞嚓陡的第5位碳原子上加上甲基基团，变成5一甲基胞嚓pig的化学修饰过程〔8-91。由于DNA的甲基化是可逆的，可以通过消除基因启动子区域的甲基化状态，使被封闭的抑癌基因重新表达，从而抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。　　DKK3是Dickkopf家族成员，位于染色体1.1P15.1上，长47100by，相对分子质量约3813/103，其编码的蛋白是Wnt受体复合体的拮抗物，能够阻止Wnt信号转导通路的经典途径，使Wnt通路异常激活或调节基因的失调，从而导致肿瘤发生，在人类乳腺癌、结肠癌、人类非小细胞肺癌以及肝癌中发现有DKK3基因启动子甲基化f9}。5-azaC0是1种特异的DNA甲基转移酶抑制剂，它可在DNA复制过程中使甲基转移酶失去活性，使原来甲基化的基因去甲基化。　　我们选择TPC-1甲状腺乳头状癌细胞，通过不同浓度的甲基化抑制剂5-azaC处理，MTT结果表明5-azaC对TPC-I细胞有明显的抑制作用。随后的RT-PCR结果也支持了这一结沦。经5-azaC处理后的『I'PC-I细胞DKK3的mRNA表达增强，且_存在剂量依赖性。接着，我们通过l}ISP证实了S-azaC可以逆转TPC-I细胞中DKK3的甲基化，恢复DKK3的表达。它提示DKK3基因启动子甲基化可能是导致其失活的主要原因之一。5-azaC可以消除TPC-I细胞株DKK3基因启动子甲基化状态，使DKK3重新表达，起到抑制细胞增殖表达的作用。　　DKK3作为一种新发现的抑癌基因，在调控细胞的生长发育和细胞凋亡过程中发挥重要而复杂的转录调节作用。本研究结果显示，DKK3基因启动子区CpG岛高甲基化与甲状腺乳头状癌发病机制密切相关，TPC-I细胞DKK3基因启动子甲基化异常可通过去甲基化制剂逆转。5-azaC针对肿瘤相关基因启动子区具有高效去甲基化作用，DKK3可能成为甲状腺癌的一个新的生物学标志和基因治疗靶点。　　参考文献　　Yin DT,Wang L,Sun J. Association of the promoter methylation and protein expression of Fragile Histidine Triad(FHIT)gene with the progression of differentiated thyroid carcinoma[J].Int J Clin Exp Patho1,2010.482-491.　　殷德涛,李红强,郑丽丽. PUMA在甲状腺乳头状癌中的表达及诱导细胞凋亡中的作用[J].中华实验外科杂志,2012,(2):230-232.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.02.022.　　Stephen JK,Chitale D,Narra V. DNA methylation in thyroid tumorigenesis[J].Cancers (Basel),2011.1732-1743.　　Lal G,Padmanabha L,Smith BJ. RIZ1 is epigenetically inactivated by promoter[J].Cancer,2006,(12):2752-2759.doi:10.1002/cncr.22325.　　韩超,李静怡,王志芳. 乳头状甲状腺癌中谷胱甘肽过氧化物酶3启动子区高甲基化与表达缺失[J].中华实验外科杂志,2012,(1):77-79.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.01.028.　　De Brouwer S,Mestdagh P,Lambertz I. Dickkopf-3 is regulated by the MYCN-induced miR-17-92 cluster in neuroblastoma[J].International Journal of Cancer,2012.2591-2598.　　Veeck J,Bektas N,Hartmann A. Wnt signaling in human breast cancer:expression of the putative Wnt inhibitor Dickkopf(DKK3) is frequently suppressed by promoter hypemrthylation in mammary tumors[J].Breast Cancer Research,2008.R82.　　Yin DT,Wang L,Sun J. Homozygous deletion but not mutation of exons 5 and 8 of the fragile histidine triad(FHIT)gene is associated with features of differentiated thyroid carcinoma[J].Annals of Clinical and Laboratory Science,2010.267-272.　　Veeck J,Dahl E. Targeting the Wnt pathway in cancer:the emerging role of Dickkopf-3[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2012.18-28.