代谢组学技术及其在医学检验中的应用

　　生命的物质代谢是一个生生不息的过程，任何病理生理过程都会影响体内物质新陈代谢的进程，继而使体液中代谢物质发生一系列的变化。通过在宏观水平上比较机体正常生理与疾病病理状态的不同，或是一种疾病病理进程上代谢产物的不同，可以帮助寻找与疾病诊断和病理相关的标志代谢物（bio-marker），进而建立相关疾病代谢物的生物化学标志物模型。由此，代谢组学应运而生。作者现就代谢组学技术进展及其在医学检验中的应用做一综述。　　1代谢组学的概念与研究内容　　1.1概念作为“代谢组学之父”的Nicholson教授于1999年提出了代谢组学概念，他将代谢组学（metabolomics）定义为：通过分析生物体系受到干扰或应激后的内源性代谢产物的变化，或者随时间变化而变化的代谢物组，来研究生物学状况和基因功能调节的现代生物医学分支学科。即代谢组学是研究生物体系（细胞、组织或生物体）在某一特定生理时期内，对所有低相对分子质量代谢产物的变化进行定性及定量分析的一种研究宏观生物体系的新兴学科[1].　　1.2研究内容代谢组学是紧随转录组学、基因组学和蛋白质组学之后发展起来的又一项新的组学技术，这几种“组学”密切联系并共同构成了系统生物学的研究内核，见图1.图1系统生物学各部分关系代谢组学的研究对象是代谢物组。所谓代谢物组是指某一生物或细胞在维持生物体正常功能、参与生物体新陈代谢和生长发育的低相对分子质量内源性代谢产物的群，其相对分子质量通常都小于1000[2].　　2代谢组学技术与方法　　代谢组学研究的主要步骤为：样品的收集处理、仪器分析、数据结果解析。这就要求生物样本（例如血液、尿液、组织细胞液等）稳定性好，预处理样本后再进行相应的检测分析，继而获得代谢组学数据，最后对原始数据进行处理和解析，获取代谢组学信息。　　2.1样品采集与保存　　包括代谢组学在内的任何研究，都首先要求设计方案的严谨性和可行性，必须先确保样品采集来源的合理性和代表性，数量、质量是否满足要求，必须将样本差异对分析研究所产生的影响降到最低。同时，在代谢物组分析测试过程中也要有严格的质量控制监督。再者，样品应尽可能保留最原始的代谢物组，避免因样品保存导致成分变化。　　2.2代谢物分析测试技术　　如何选择合适的方法对样品中的代谢物组分进行全面分析，是代谢物组学研究的关键。因为在现有技术条件下，很难依据单一的分析方法来建立较为全面的代谢组学模型，故联用技术和多种方法进行综合分析是较好的研究手段。目前，包括有核磁共振（nuclearmagneticreso-nance,NMR）、液相色谱（liquidchromatography,LC）、高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）、气相色谱-质谱联用（gaschromatography-massspectrometer,GC-MS）、液相色谱-质谱联用（liquidchromatography-massspec-trometer,LC-MS）等技术。　　2.2.1NMR技术NMR技术　　是使用最常用的代谢组学研究技术之一，是利用原子核的自旋角动量在外加磁场作用下能量跃迁的原理发展起的分析信息技术。常用种类包括：氢核磁共振波谱法（1H-NMR）、碳核磁共振波谱法（13C-NMR）和磷核磁共振波谱法（31P-NMR），其中以1H-NMR应用最为广泛，具有样品处理简单、进样量少、快速、无损、重复性好等优点。但灵敏度低是NMR技术最大的缺点。随着NMR技术的快速发展，常用检测方式有原位活体组织萃取液的高分辨氢核磁共振波谱法、生物体液的立体高分辨氢核磁共振波谱法和原位活体组织的高分辨氢核磁共振波谱法及活体定域MR谱等[3].随着这些代谢组学技术的发展和广泛应用，对肿瘤的早期诊断和预后监测有重大意义[4].　　2.2.2MS技术MS技术　　是一种与光谱并列的谱学方法，通过相对分子质量/电荷比（m/z）的不同，用电场（或电磁场）将不同物质区分开，再通过对信号进行探测来确定其质量。与NMR相比，其具有灵敏度高、分辨率强及特异性好的优点[5],但其样品前处理较复杂。近年来，发展较快的高分辨飞行时间MS技术、三重四级杆MS技术和串联四级杆线性离子阱MS技术等常用于代谢组学研究中。GC-MS联用：指GC仪经接口与MS仪结合而构成的GC-MS的分析技术，主要用于分离挥发性化合物，有效率高、灵敏度好、用量少、应用范围广等优点。LC-MS联用：主要应用于低挥发性或非挥发性、热稳定性差的极性化合物。因GC必须由已知标准作参照，无法直接从色谱图给出未知物的定性分析，也不能测量包括蛋白质、多肽、多聚物的大分子化合物，而但LC可弥补这一缺点。现常用的LC技术有HPLC及超高效液相色谱法（ultra-performanceliq-uidchromatography,UPLC）等毛细管电泳（CE）-MS联用：是以毛细管为分离通道，根据离子的迁移速度、电荷及颗粒大小对样本中各组分进行分离，与传统的分离方法相比，CE的特点是简单、高效、快速和微量。　　2.3代谢组学数据处理代谢组学要如何对样本中所有代谢组进行系统、整体的研究呢？这就必须依赖多元统计分析的数据提取方法。其常见应用方法有主成分分析、聚类分析、主成分判别分析、偏最小二乘法-判别分析、辨别式功能分析、非线性回归等。同时，代谢组学数据解析离不开各种代谢途径和生物化学数据库，见表1.　　3代谢组学研究的优、缺点　　与其他临床研究技术相比，代谢组学显示出了其独特的优点：　　（1）创伤小，无需穿刺提取活检组织，利用体液、尿液和血液等生物系统代谢物进行疾病诊断，实现快速、非侵袭性诊断；　　（2）结果内容丰富，可以得到整体水平的信息；　　（3）快速、大量，平均检测时间为5~20s,可一次性扫描96孔板上全部的样品；　　（4）分析检测容易，一切外源性刺激最终都会导致代谢物的变化；　　（5）代谢物种类跟基因和蛋白的数目相比，数量很小，便于分析；　　（6）由于代谢物存在于组织中任何部分，故该研究技术更适用于临床检测。代谢组学研究也有许多不足之处：　　（1）代谢物组分析手段只是新兴技术，刚起步，尚无任何一个技术可以同时对机体全部代谢物组进行分析；　　（2）数据分析手段还需要发展；　　（3）生物体代谢物组的稳定性较难控制；　　（4）代谢物组的仪器设备价格较高，所需较强的专业性，一般实验室难以开展；　　（5）缺乏关于代谢物组全面、标准的数据库；　　（6）容易受生理、药理效应影响，导致假阳性结果；　　（7）体液的选择具有局限性，如神经系统病理学研究时，尿液与脑脊液所得结果会有区别。　　4代谢组学在临床检验诊断中的应用　　以往的疾病诊断，主要集中在检测与疾病相关的系统的生物标志物，但代谢组学分析是从宏观上分析机体整体的代谢物组变化。　　4.1循环系统疾病诊断Brindle等[6]应用NMR技术，建立的冠心病代谢组学诊断模型，这种判别心血管疾病及其严重程度的诊断新模式，有着高达92%的敏感性及89%的特异性，可以区分不同病变程度患者。Nasokawa等[7]用GC-MS技术对冠状动脉支架术后再狭窄患者的血清进行分离，共发现83种显着变化的化合物，并以其中异丁胺、肌氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、核酮糖、葡萄糖和色氨酸8种生物标志物为指标，对术后再狭窄患者进行诊断，有着83%的准确率。因此，代谢组学技术在心脏疾病的诊断中具有独特优势和潜力。　　4.2消化系统疾病诊断Marchesi等[8]建立的基于1H-NMR技术的代谢组学诊断模型，可以早期、快速并且非侵袭性的诊断肠炎。Yin等[9]建立的基于UPLC-Q-TOF-MS的代谢组学模型，发现了与肠瘘相关的9个生物标志物。Chen等[10]以血清中血脂酰胆碱，长链和中链酰基肉碱等的代谢终产物为研究对象，建立的HPLC-MS的代谢组学诊断模型，可以有效区分肝炎、肝硬化及肝癌患者。　　4.3泌尿系统疾病诊断Psihogios等[11]建立的基于1H-NMR技术评估肾小管间质损害程度的模型，对肾小管间质轻、中、重等不同程度损害进行区分，有着高达96%的敏感性和99%的特异性。Tzovaras等[12]建立的基于NMR技术来研究高尿酸血症模型，发现苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、乙酸盐等生物标志物有助于疾病的早期诊断。　　4.4内分泌系统疾病诊断Mkinen等[13]建立的基于NMR的2型糖尿诊断代谢组学模型，有着高达95.5%的敏感性和87.1%的特异性。Floegel等[14]利用GC-MS技术研究有机酸在2型糖尿病患者尿液中的水平变化，鉴别出了5种与疾病发生相关的生物标记物，可以用于2型糖尿病的诊断。　　4.5肿瘤的诊断Odunsi等[15]应用1H-NMR技术建立依据血清标志物鉴别上皮性卵巢癌的诊断模型，有着100%的敏感性和特异性。Corona等[16]用串联MS法进行血清代谢组学研究，发现包括不同类别的代谢产物，如丝氨酸、组氨酸、色氨酸、胱氨酸和甘油磷脂等在乳腺癌诊断中有重要意义。　　4.6其他疾病的诊断代谢组学技术还应用免疫性疾病研究中，Romick-Rosendale等[17]建立基于1H-NMR检测系统性红斑狼疮患者尿液的代谢组学模型，可以在早期区分不同类别的统性红斑狼疮患者。同时，代谢组学也可用于产妇早产的预测。　　5展望　　代谢组学研究的不断发展，使其广泛应用于临床疾病的诊断、药物开发、营养与食品安全学、微生物等领域。目前，代谢组学的研究还处于初级阶段，但结合代谢组学技术发展有效的疾病诊断方法已成为生物医学领域的前沿和热点，已在临床诊断领域展示出了广阔的应用前景。　　参考文献　　[1]GoodacreR.Makingsenseofthemetabolomeusingevolutionarycomputation:seeingthewoodwiththetrees[J].JExpBot,2005,56（410）：245-254.　　[2]TweeddaleH,Notley-McrobbL,FerenciT.EffectofslowgrowthonmetabolismofEscherichiacoli,asrevealedbyglobalmetabolitepool（“metabolome”）analysis[J].JBacteriol,1998,180（19）：5109-5116.　　[3]LenzEM.Nuclearmagneticresonance（NMR）-baseddrugme-taboliteprofiling[J].MethodsMolBiol,2011,708（4）：299-319.　　[4]BathenTF,SitterB,SjobakkTE,etal.Magneticresonancemetabolomicsofintacttissue:abiotechnologicaltoolinCancerdiagnosticsandtreatmentevaluation[J].CancerRes,2010,70（17）：6692-6696.　　[5]PaigeLA,MitchellMW,KrishnanKR.Aprelminarymetabolomicanalysisofolderadultswithandwithoutdepression[J].IntJGeri-atrPsychiatry,2007,22（5）：418-423.　　[6]BrindleJT,AnttiH,HolmesE,etal.Rapidandnoninvasivediag-nosisofthepresenceandseverityofcoronaryheartdiseaseusing1H-NMRbasedmetabonomics[J].NatMed,2002,8（12）：1439-1444.　　[7]HasokawaM,ShinoharaM,TsugawaH,etal.Identificationofbiomarkersofstentresten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