利用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4和CD8封闭效率在反复自然流产中的应用

封闭抗体主要是指孕妇针对胚胎主要组织相容性抗原(MHC)、滋养层细胞及淋巴细胞交叉反应抗原(TLX)产生的特异性IgG 类抗体[13]。正常状况下，封闭抗体从妊娠初期开始产生，至妊娠3 个月达到最高，以后逐渐下降，分娩时又增高。封闭抗体缺乏是造成早期复发性自然流产(RSA)的重要因素之一[4]。因此，目前临床上对于RSA 封闭抗体检测主要采用ELISA 方法，该方法是将MHC 混合抗原包被于96孔板中，检测受检者的血清中是否存在MHC 的抗体。该方法的设计理念是从源头寻找RSA 的致病因素，但是由于RSA 是多因素的集合体，因此，还有很多RSA 患者不能单纯用是否缺乏封闭抗体来进行解释。本研究从免疫应答的结局上寻找RSA 发生的原因，即利用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4和CD8的封闭效率，通过该方法，其目的是建立快速、准确、简便易行的手段，有利于临床诊断和疗效观察，同时可以进一步对RSA 的免疫学发生机制进行解释。

1　资料与方法

1.1　一般资料　反复自然流产组(RSA 组)标本来源于郑州大学第三附属医院2011年7月至2013年5月门诊就诊患者，共计1638 例，年龄20～46 岁，平均(32±6.8)岁。其诊断标准为患者有2次或2次以上的自然流产病史，同时排除夫妇双方染色体异常、母体生殖道解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染和自身免疫病等;健康对照组为正常妊娠来本院进行孕期保健者，共计100例，其妊娠均在12 周以内，年龄24～36 岁，平均(27±2.9)岁，且既往无自然流产、死胎、死产史，同时排除夫妇双方染色体异常、母体生殖道解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染和自身免疫病等，本次妊娠期间无阴道流血和腹痛等先兆流产症状和体征，超声检查证实胚胎发育正常者。

1.2　试剂　CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP混合单克隆荧光抗体、红细胞裂解液购自美国BD 公司;淋巴细胞分离液(北京鼎国生物技术公司)。

1.3　方法　采集夫妇双方静脉血，并用EDTANa2 抗凝。采用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面标志CD3/CD4/CD8阳性细胞百分数。每对标本取2支流式细胞专用管，第1管为对照管，加入男方血浆和全血各50μL，第2管为测定管，加入女方血浆和男方全血各50μL;然后再加入10μLFITCCD3/PECD4/APCCD8混合单克隆荧光抗体;震荡混匀，室温避光15min;加入1× 红细胞裂解液，混均，室温避光10 min;0.1mol/LPBS洗涤3 次，每次1500r/min，5min;最后加入100μLPBS，等待上机。封闭效率(%)= 对照管CD3/CD4/CD8阳性细胞百分数- 测定管CD3/CD4/CD8 阳性细胞百分 数;结果判定：CD3、CD4 和CD8 封闭效率只要有一项出现负值，提示封闭抗体缺乏;三项封闭效率均为正值，提示正常。免疫治疗：分离获取RSA 患者丈夫或无关健康第三者抗凝静脉血30mL，并提取单个核细胞，调整细胞浓度为(5～10)×107/mL，每次取100μL 分3～5点注入女方前臂皮下，3次为一个疗程，每次间隔2～3周。治疗1个疗程后进行封闭抗体检测，若封闭抗体转阳鼓励患者6个月内自然妊娠，并在妊娠前3个月加强免疫治疗;若封闭抗体仍为阴性，则进入下一个疗程治疗。

1.4　统计学处理　数据以狓±狊表示，采用SPSS11.0统计软件分析，组间比较采用两样本χ 2 检验。p<0.05 表示差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　RSA 组与健康对照组封闭抗体缺乏率　1638 例RSA患者中封闭抗体阴性(只要CD3/CD4/CD8封闭效率中有一项出现负值即规定为封闭抗体缺乏)1459例，阴性率为76.86%(1259/1638)，100例健康对照组中封闭抗体阴性8 例，阴性率为8.00%。RSA 组封闭抗体阴性率明显高于健康对照组，差异有统计学意义(p<0.01)。

2.2　T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4 和CD8 的封闭效率　RSA 组中，CD3封闭效率为(-2.8±1.9)%，CD4封闭效率为(-1.8±1.2)%，CD8封闭效率为(-1.2±1.2)%;而健康对照组CD3封闭效率为(1.5±1.0)%，CD4 封闭效率为(0.6± 0.6)%，CD8封闭效率为(0.9±0.5)%。RSA 组和健康对照组中CD3、CD4和CD8封闭效率之间比较差异有统计学意义(p<0.01)

2.3　RSA 患者T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4 和CD8 封闭效率阴性百分比　在RSA 患者中，CD3 封闭效率阴性占71.01%;CD4封闭效率阴性占64.10%;CD8封闭效率阴性占76.41%。RAS患者中CD8封闭效率阴性比CD4封闭效率阴性所占比例更高，差异具有统计学意义(p<0.01)。

2.4　免疫治疗后封闭抗体封闭效率转阳情况　993例接受免疫治疗的RSA 患者中，经过1个疗程免疫治疗后，封闭抗体转阳为418 例，占42.09%;2 个疗程治疗封闭抗体转阳为359例，占36.15%;3个及3个以上疗程后封闭抗体转阳87例，占8.76%;其他为正在继续或放弃治疗，见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.5　免疫治疗后RAS 患者怀孕情况　接受免疫治疗抗封CD3、CD4和CD8均转阳后的RAS病例共864例，其中657例已经证实怀孕，怀孕率为76.04%。

3　讨　　论

封闭抗体缺乏是造成RSA 的重要因素之一。目前临床上对于RSA 的诊断和治疗监测主要是通过ELISA 方法检测母体中是否含有抗混合HLA 抗体[57]。但是，由于封闭抗体的复杂性，目前还不能做到对各种封闭抗体进行全面、快速、准确和定量检测。因此，本研究将从怀孕失败的免疫结局入手，利用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4 和CD8 封闭效率，以达到快速、准确和定量地检测RAS患者是否是由于缺乏封闭抗体而造成的反复自然流产，便于进行临床诊断、治疗和对疗效的观察，同时可以进一步揭示和补充RSA 发病的免疫学机制。在妊娠早期，胚胎周围通常浸润有一定数量的淋巴细胞，并且以T 淋巴细胞为主[810]。CD3、CD4 和CD8 分子作为T淋巴细胞的分化抗原，主要参与信号的转导，而且也是T 淋巴细胞亚群分类的分化抗原标志。CD3+CD4+ T 淋巴细胞代表辅助性T 淋巴细胞，而CD3+CD8+T 淋巴细胞代表细胞毒型/抑制型T 淋巴细胞。这也是利用检测T 淋巴细胞表面分子封闭效率预测是否为原因不明的免疫性RSA 的重要基础。本研究表明：健康对照组CD3、CD4和CD8封闭效率分别为(1.5±1.0)%，(0.6±0.6)%，和(0.9±0.5)%;而RAS组CD3、CD4和CD8封闭效率分别为(-2.8±1.9)%，(-1.8± 1.2)%，(-1.2±1.2)%。两者比较差异有统计学意义(p<0.01)，因此，现暂定为若CD3、CD4和CD8封闭效率只要有一项出现负值即代表缺乏封闭抗体;三项均为正值说明封闭抗体阳性，对胚胎植入以及生长、发育具有保护性。通过分析CD3、CD4和CD8 分子的封闭效率发现在RSA患者中CD8 封闭效率阴性占76.41%，高于CD4 封闭效率阴性率(CD4 封闭效率阴性占64.10%)，暗示着CD8 分子在RSA 中发挥更为重要的作用。胎儿表达的父源性主要组织相容性复合物(MHS)与肿瘤抗原一样，均属于内源性抗原，主要启动CD3+CD8+T 淋巴细胞的应答。在正常怀孕状况下，由于母体的免疫系统能够正好识别父源性MHC 分子并诱导机体产生保护性的封闭抗体，这些保护性抗体可以通过特异性与T 淋巴细胞表面的CD3和CD8分子结合，干扰了CD3+CD8+T 淋巴细胞向细胞内传递第一信号系统，使细胞免疫得到一定程度的抑制，胎儿得以继续生长发育。通过进一步对临床免疫治疗后怀孕结果的观察也发现：CD8 封闭效率是否转阳对于能否正常怀孕和度过流产危险期是非常重要的。研究者对20例进行封闭抗体治疗期间怀孕妇女(CD3、CD4和CD8封闭效率存在一项或者两项负值)进行临床观察与回访发现：CD8 封闭效率转阳而CD4封闭效率仍为阴性的妇女有8 例怀孕，其中1例再发流产;而CD4封闭效率转阳但CD8 为阴性的妇女仅有3例怀孕，其中1例再发流产。因此，通过封闭抗体治疗的结果，从另一个侧面说明CD3、CD4和CD8封闭效率检测方法可以更直观为临床提供治疗依据、预测风险指标和再发RSA 评估。之所以CD3、CD4和CD8封闭效率可以作为RSA 封闭抗体的检测，可能机制是：正常免疫状态下，机体本身就可以微量产生抗自身T 淋巴细胞表面抗体，即抗CD3、CD4和CD8的抗体，以保持T 淋巴细胞生理功能的平衡;而当父源性MHC 分子通过皮下注入女方体内，实际上是给予女方以抗原刺激，这些外源性抗原在树突状细胞的作用下，将外源性抗原进行处理，并提成给B淋巴细胞，不仅可以产生抗父源性MHC 的特异性抗体，同时可以通过旁路活化途径使预存于机体中的具有产生抗CD3、CD4和CD8的B 淋巴细胞克隆大量活化，进而产生相应的抗淋巴细胞表面CD3、CD4和CD8抗体，而这些抗体正是可以保护胚胎着床以及生长发育的保护性抗体。CD3、CD4 和CD8 封闭效率检测也可以为治疗效果进行评估。ELISA 方法对封闭抗体的检测通常是一种定性的方法，受到干扰的因素比较多，而CD3、CD4 和CD8 分子封闭效率检测是针对女方体内是否具有抗CD3、CD4 和CD8 的特异性抗体，因此干扰因素较少，不仅可以定性，而且可以定量，有利于对治疗效果及过程进行全程监测，更有利于临床对免疫治疗效果的评价。

参考文献

[1] TothB，JeschkeU，RogenhoferN，etal.Recurrentmiscarriage：currentconceptsindiagnosisandtreatment[J].ReprodImmunol，2010，85(2)：2532.

[2] JaslowCR，CarneyJL，KuttehWH.Diagnosticfactorsidentifiedin1020womenwithtwoversusthreeormorerecurrentpregnancylosses[J].FertilSteril，2010，93(1)：12341243.

[3] 苏琳，孙燕，欧珊，等.淋巴细胞主动免疫治疗复发性流产的疗效分析[J].吉林医学，2012，33(9)：18221823.

[4] 林其德.现代生殖免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2006：157.

[5] SipakSzmigielO，RoninWalknowskaE，CybulskiC，etal.AntigensHLA G，sHLA GandsHLAclassⅠinreproductivefailure[J].FoliaHistochem Cytobiol，2007，45Suppl1：S137141.

[6] WilczyńskiJR，RadwanP，TchórzewskiH，etal.Immunotherapyofpatientswithrecurrentspontaneousmiscarriageandidiopathicinfertility：doestheimmunizationdependentTh2cytokineoverbalancereally matter?[J].ArchImmunolTherExp，2012，60(2)：151160.

[7] 曹文丽，叶玲玲，姜雯，等.复发性流产的免疫因素及抗免疫治疗效果的评价Ⅲ[J].中国妇幼保健，2010，25(8)：11181119.

[8] Pandey MK，ThakurS，AgrawalS.Lymphocyteimmunotherapyanditsprobable mechanisminthe maintenanceofpregnancyinwomenwithrecurrentspontaneousabortion[J].ArchGynecolObstet，2004，269(3)：16172.

[9] MatthiesenL，KalkunteS，SharmaS.Multiplepregnancyfailures：animmunologicalparadigm[J].AmJReprodImmunol，2012，67(4)：33440.

[10]PerriconeC，deCarolisC，PerriconeR.Pregnancyandautoimmunity：acommon problem [J].BestPract Res Clin Rheumatol，2012，26(1)：4760.

(收稿日期：20131208)