SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪计数L型大肠埃希菌研究

　　细菌L型(bacteriaIL-forms)即细菌细胞壁缺陷型(cellwall-deficientbacteria，CWDB)，是细菌等微生物细胞壁缺陷的变异型[1]。β-内酰胺类抗菌药物[2-4]、75%乙醇、聚维碘酮[5]等均可导致细菌L型形成。尿沉渣分析仪的细菌计数在泌尿系感染快速诊断中应用价值，已在多篇文献中证实[5-6]。当细菌由普通形态变成L型后，在尿沉渣分析仪中细菌计数特点，尚未见专门研究。为了解细菌L型在尿沉渣分析仪中的计数特点，本文以大肠埃希菌为例，进行以下研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　菌种　大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922株)购于广州天和微生物有限公司。

　　1.2　主要仪器与试剂　氨苄西林购于河南新乡华星药厂，SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪及配套试剂(包括质控品)购自日本希森美康医用电子有限公司，血平板由安图生工有限公司提供，L型培养基购自杭州天和微生物有限公司，滤纸购自杭州新华集团有限公司，一次性针头式过滤器(0.45 μm)购自天津津腾公司，PhoenixSpecTM比浊计购自美国BD公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　大肠埃希菌-L型的诱导　参照文献[2]并加以改进。(1)制备每片200μg氨苄西林药物纸片：用无菌生理盐水稀释药粉，取含1g氨苄西林干粉倍比稀释成20μg/μL的水溶液，每张无菌小纸片滴加10μL，干燥后制成。(2)L型培养基制备：制备85-7无血浆L型固体平板培养基。(3)L型诱导：采用平板纸片法，在L型平板上用每片200μg氨苄西林药物纸片不断传代诱导成L型，逐日观察，取生长物涂片作革兰氏染色和细胞壁染色并观察细菌形态及染色性的变化。连续诱导7～10代后，用0.45μm一次性无菌滤嘴加压过滤，获得L型菌，再继续传代一次。(4)细菌L型检测：采用细胞壁染色法，细菌涂片后自然干燥，先加10%鞣酸水溶液固定15min，水洗后加0.5%结晶紫溶液染3min，水洗，干燥后镜检。细菌型菌体仅细胞壁着色呈空泡状，示细胞壁完整;细菌L型因细胞壁缺损，菌体浓染。

　　1.2.2　菌悬液的配制及菌液浓度的验证　挑取具有典型L型形态的菌落，无菌生理盐水配制菌悬液，用0.45μm一次性无菌滤嘴加压过滤制备0.15麦氏点浊度菌悬液，用培养法验证细菌浓度，方法同文献[7]。

　　1.2.3　SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪细菌计数　将培养后剩余菌悬液混匀后，立即用SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪进行细菌计数(分别测定3次，求均值)，记录检测结果并分析理论浓度与尿沉渣细菌计数间的相关性。

　　2　结　　果

　　2.1　大肠埃希菌L型观察　在L型平板上药物纸片抑菌圈处，诱导2～3代后开始发现有细菌L型颗粒状菌落，见图1A;涂片染色可见革兰氏阴性，长短、弯曲程度不一的杆菌，可见圆球体，见图1B;继续培养至第7代，涂片有许多圆球体、长丝体缠绕在一起，偶见巨形体，见图1C～D;继续诱导传代，细菌菌落形态均为典型颗粒型，未见油煎蛋及丝状体菌体形态，用此法诱导出来的大肠埃希菌L型在诱因存在条件下保持相对稳定，去除诱因易返祖。

　　2.2　大肠埃希菌L型菌悬液浓度验证及相关性分析　大肠埃希菌L型理论细菌浓度与培养菌落浓度呈正相关(r=0.974，p<0.05)，见图2。

　　2.3　SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪细菌计数结果　大肠埃希菌L型理论细菌浓度与SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪细菌计数结果呈正相关(r=0.969，p<0.05)，见图3。

　　3　讨　　论尿路感染(UTI)是临床常见病和多发病，严重危害人类健康和生活质量，所以及时准确的诊治显得尤其重要[8]。尿液检查以其简便、快捷、标本易得、结果有效而被临床广泛应用[9]。相比UTI诊断的金标准(尿液培养)的较长报告时间，尿沉渣细菌计数已被临床科室用于UTI的快速诊断。但是，随着抗菌药物的广泛应用，临床上部分UTI患者，即使出现明显症状，却不能通过常规的尿细菌培养确诊，此时应考虑L型细菌感染的可能[8]。细菌的细胞壁缺陷既包括天然具有细胞壁的各种细菌在受到影响细胞壁合成或破坏细胞壁结构的因素作用下形成的细胞壁缺陷变异型，也包括天然缺乏细胞壁的支原体[10]。对于UTI细菌感染症的病原学诊断与治疗来说，研究天然缺乏细胞壁的支原体具有更加重要的意义。细菌L型由于缺失细胞壁，在分裂时不能像原菌那样按时断裂，可膨胀成巨形体，或在其中增殖、破裂成原生小体(如无壁的病毒)，或因不能按时分裂而增殖成长丝[1]。在普通光学显微镜下常见形态特征为明显大于经典细菌型的圆球形和长丝形，其中圆球形的L型细胞直径可小于0.01μm或大于50μm，丝形L型的长度和宽度都显著大于各种经典细菌型[10]。目前已有使用全自动尿沉渣分析仪进行细菌计数时，大量成堆细菌菌团误认为红细胞的相关报道[11]。当形态明显异于正常细菌的L型原球体或丝状体存在的情况下，是否会干扰尿沉渣分析仪的细菌计数?L型细菌在仪器中细菌计数的特点又是怎样的?解决上述问题是本次研究的目的。本文采用平板法，以临床常见的抗菌药物对大肠埃希菌诱导，发现在氨苄西林诱导作用下，大肠埃希菌的菌落变成颗粒型，而菌体形态则由最初的革兰阴性小杆菌逐渐变成长杆菌、圆球体、丝状菌、巨形体，当菌液浓时成为丝状，可形成网状，类似于真菌菌丝，与正常菌体有明显区别。在本研究中，大肠埃希菌L型在SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪中的细菌计数，理论浓度与仪器细菌计数之间有较大的差导，并且尿沉渣细菌计数明显低于理论浓度，说明尿沉渣分析仪的细菌计数并不能准确反映L型细菌实际浓度，这一计数特点与细菌型相同，原因还可能是与细菌的聚集性相关[7]。但是，细菌型在同一尿沉渣分析仪细菌计数较细菌L型高出近一倍，此差异是否能说明同一细菌的细菌型在尿沉渣分析仪的计数一定就大于L型?作者认为是否定的，理由有3点：(1)由L型菌生长特性决定，其液体培养基内都表现为沉淀生长，混悬在生理盐水或蒸馏水内也可迅速沉积，可导致吸样不均匀;(2)检测结果重复性不佳，由于细菌的聚集程度、振摇程度不同，导致结果有较大的差异;(3)细菌L型分为稳定L型、相对稳定L型与不稳定L型，稳定L型不论是在不含诱导剂的培养基中多次传代培养或是在动物体内，都能够保持相对稳定的性质或不能自发返祖[10]。而本次研究仅诱导出相对稳定L型与不稳定L型，尚不能预知稳定L型在尿沉渣分析仪中的特点。但是根据稳定L型无法自发返祖导致了培养困难的特点，推测此型菌用SysmexUF-500i全自动尿沉渣分析仪计数可能会出现尿沉渣分析仪细菌计数阳性但培养阴性的结果。因此，对泌尿系统感染的诊断除了缩短检验时间，改进检测方法的特异性与敏感性外，在临床用药前进行尿液标本的送检，避免L型细菌的形式，也是快速准确诊断与治疗的关键。

　　参考文献

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　　(收稿日期：2013-08-28)