高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白的影响
发表时间：2010-05-21 浏览次数：623次
作者：曹东维,张苗,何劲松,蒋春明 作者单位：南京大学医学院附属鼓楼医院肾科，江苏南京210008)
【摘要】 目的 研究高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白(connexin43)表达的影响。方法 分离培养人腹膜间皮细胞，细胞分为3组:正常糖组(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(含140 mmol/L葡萄糖)和渗透压对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖加24.5 mmol/L甘露醇),培养24、48 h后，应用Northern blot、Western blot方法检测connexin43 mRNA和蛋白质表达，比较3组之间的差异。结果 正常糖组腹膜间皮细胞表达丰富的connexin43，高糖环境下培养的腹膜间皮细胞connexin43 mRNA和蛋白质表达均较正常糖组显著下降(P<0.05)。渗透压对照组与正常糖组之间无明显差异(P>0.05)。结论 高糖可抑制腹膜间皮细胞connexin43 mRNA和蛋白质表达，可能为腹膜透析(PD)中腹膜间皮层完整性损伤的机制之一。
【关键词】 腹膜间皮细胞;connexin43;腹膜透析
Effect of high glucose on connexin43 expression in humanperitoneal mesothelial cellsCAO Dongwei, ZHANG Miao, HE Jinsong, JIANG Chunming(Department of Nephrology, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing, Jiangsu 210008, China)Abstract： Objective To investigate the effect of the high glucose concentration on the connexin43 expression in the cultured human peritoneal mesothelial cells (HPMC). Methods HPMCs isolated and cultured in vitro were divided into normal glucose group (5.5 mmol/L), high glucose group (140 mmol/L) and osmotic control group (5.5 mmol/L glucose group plus 24.5 mmol/L mannitol). At 24 h and 48 h of culture, the expression of connexin43 mRNA and protein was determined by Northern blot and Western blot, and the differences between the 3 groups were compared. Results HPMC in the normal glucose group expressed rich connexin43. The mRNA and protein expression of connexin 43 was reduced in high glucose group as compared to the normal group (P<0.05). There was no evident difference in mRNA and protein expression of connexin43 between osmotic pressure group and the normal group (P>0.05). Conclusion High glucose concentration can inhibit connexin43 expression in HPMC, which might contribute to the mechanism of the integral damage to the peritoneal mesothelium during prolonged peritoneal dialysis.
Key words： peritoneal mesothelial cells; connexin43; peritoneal dialysis
腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是终末期肾病肾脏替代疗法中的主要方法之一。但是,腹膜长期暴露于非生理性的PD液中(低pH、高浓度葡萄糖以及高渗透压)会致腹膜纤维化，从而导致腹膜结构和功能的丧失，这是患者放弃腹膜透析的原因之一[1-2]。近年来的研究发现,PD导致人腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells， PMC)的形态学改变,如微绒毛的丧失、细胞间隙增宽以及细胞脱落。腹膜间皮细胞脱落后,高渗葡萄糖一方面干扰间皮的再生,一方面造成裸露的间皮下基质重构,导致成纤维细胞增生及细胞外基质的积聚,最终形成腹膜纤维化,超滤功能丧失,终止PD[3]。因此,造成腹膜纤维化最关键的始动因素就是PMC损伤、脱落[4-5]。而PMC脱落是由于其细胞间隙连接结构遭到损害所致。PMC间的连接包括紧密连接、间隙连接、桥粒以及粘合连接。间隙连接是由两个相邻细胞膜上紧密装配的连接蛋白组成的通道结构，连接蛋白分为很多亚型，其中分布最广的是connexin43。
本研究通过体外观察高糖对人PMC细胞间通讯功能和连接蛋白connexin43的影响,探讨高糖对人PMC间通讯功能的影响机制,为防治腹膜纤维化——PD最主要的并发症提供可靠的理论依据。
1 材料和方法
1.1 人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定 取非尿毒症和糖尿病择期手术患者的网膜作为细胞来源,按文献[6]法培养间皮细胞。腹膜间皮细胞培养在含血清的RPMI 1640培养基，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养,当细胞生长融合时用胰酶消化,按1∶3传代,继续培养,第3代用于实验。经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性,抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性鉴定。
1.2 细胞分组 腹膜间皮细胞培养至亚融合后加入无血清RPMI 1640培养基,同步化培养24 h,并调整葡萄糖浓度为以下3组:①正常糖组(含5.5 mmol/L葡萄糖);②高糖组(含140 mmol/L葡萄糖);③渗透压对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)。分别培养24、48 h后进行各项指标检测。
1.3 Northern blot检测腹膜间皮细胞connexin43 mRNA的表达 参照Trizol试剂盒(美国Sigma公司)说明书提取细胞总RNA，采用紫外分光光度仪判断RNA的质和量。140 μg总RNA经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后，转移至尼龙膜，紫外交联固定。42℃预杂交2 h,以α-32P-dCTP随机引物法标记探针，42℃杂交16 h后洗膜，-70℃放射自显影72 h。UVP凝胶成像系统记录、分析灰度值。
1.4 Western blot检测腹膜间皮细胞connexin43蛋白质的表达 腹膜间皮细胞生长至80%融合，PBS冲洗2遍，用RAPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒(美国Pierce)测定所提取的蛋白浓度，取50 μg蛋白样品，95℃变性5 min后，12%的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，采用电转印法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，膜在含10%脱脂奶粉的TBST中室温封闭4 h，加1∶500 connexin43的抗体，4℃过夜，TBST充分洗涤后加1∶1 000 HRP标记的二抗室温作用1 h，洗膜后用ECL系统显色。
1.5 统计学处理 数据用±s表示，SPSS 12.0统计软件对所得数据进行分析，3组之间的比较采用方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 高糖对腹膜间皮细胞connexin43 mRNA表达的影响 高糖组培养的细胞24 h时connexin43 mRNA表达显著降低，与正常糖组及渗透压对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，48 h更显著，见图1。
2.2 高糖对腹膜间皮细胞connexin43蛋白表达的影响 高糖可抑制腹膜间皮细胞connexin43蛋白的表达，24 h后高糖组细胞connexin43蛋白较正常糖组和渗透压对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，48 h差异更加显著，见图2。
3 讨 论
腹膜透析作为有效的肾脏替代治疗方法已经被越来越多的尿毒症患者所接受,随着腹膜透析时间的延长,腹膜发生纤维化导致腹膜功能衰竭是患者退出治疗的主要原因之一。含糖腹膜透析液具有明显的生物不相容性,其导致腹膜间皮细胞损伤被认为是腹膜透析相关腹膜纤维化的关键因素。而有效保护腹膜间皮细胞则可以明显延缓腹膜纤维化的进程。研究表明[7]腹膜透析液相关浓度的葡萄糖可使腹膜间皮细胞端粒长度缩短，细胞周期停滞于G1期，细胞周期蛋白P21表达增加。但是有关高糖对腹膜间皮细胞间隙连接蛋白和细胞间通讯功能影响的研究极少。本研究从基因和蛋白质的角度初步探讨了高糖对腹膜间皮细胞间隙连接蛋白的影响。
间隙连接是由相邻的两个细胞膜上紧密装配的连接蛋白组成的通道结构，是大多数动物细胞间进行物质和信息交换的关键结构，可以传递相对分子质量小于1 000的分子及离子，如钙离子、核苷、氨基酸等，在胚胎发育、细胞增殖分化的调节等方面具有重要作用[8]。connexin43是分布较广的连接蛋白，它不仅仅是能形成细胞间通道的蛋白，其本身具有调节细胞增殖、凋亡等重要功能[9]。最新研究表明connexin43对WI38细胞的衰老进程有重要的调节作用，其表达减少和细胞间通讯功能降低，可以促进WI38细胞的衰老进程[10]。
在长期腹膜透析中，腹膜间皮细胞可因持续暴露于高糖腹透液中而出现细胞肥大、细胞分裂停滞、细胞周期蛋白改变等表现。在本实验中，我们从基因、蛋白质表达层次研究了高糖对腹膜间皮细胞间通讯功能的影响及机制。研究发现，高糖培养的腹膜间皮细胞connexin43 mRNA和蛋白质表达均较正常糖组下降，表明高糖抑制了connexin43的转录和翻译过程，使其蛋白合成减少，间隙连接通道的组装、形成随之减少。
因为细胞间隙连接通讯功能对调节细胞生长、增殖等表型功能及细胞间代谢、同步收缩有重要作用，高糖状态下细胞间传递钙离子、钾离子、cAMP、ATP等生长信息和第二信使分子减少，可能是腹膜间皮细胞出现增殖能力下降、细胞周期进展停滞和细胞肥大，继而分泌细胞外基质增多，最终导致腹膜纤维化的重要原因之一。因此，高糖对connexin43的抑制从而导致腹膜间皮细胞间通讯功能的抑制作用可能参与了腹膜透析相关性腹膜纤维化的病理生理进程。
【参考文献】
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