水甘油通道蛋白9短发夹RNA的构建与筛选及其对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的作用

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪储存为特征的临床病理综合征。目前,我国NAFLD发病率迅速增加,已成为危害人民健康的主要消化系统疾病之一。针对NAFLD尚没有理想药物,迫切需要一种有效预防和治疗的方法。NAFLD与脂肪重新分布有关,而脂肪动员、运输和肝脏摄取又与水甘油通道蛋白具有一定的相关性。人类AQP9主要表达于肝细胞窦状隙膜上,能将血液中甘油转运进入肝细胞,大量甘油进入肝细胞将引起脂肪合成及蓄积增加,导致NAFLD的形成。所以,AQP9是NAFLD发生和发展的参与者及重要环节,针对AQP9的基因靶向治疗可能成为NAFLD治疗和预防的重要手段之一。本研究构建针对人AQP9的干扰质粒pshRNA-AQP9,经油酸诱导Lu细胞脂肪变性建立NAFLD细胞模型,通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测pshRNA-AQP9对NAFLD细胞模型的作用,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础。　　材料与方法　　细胞株及试剂:人肝细胞株L02购自中国科学院上海细胞库;RNAisoPlus、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒及限制性内切酶和T4DNA连接酶购自大连TaKaRa公司;凝胶回收试剂盒,质粒小量提取试剂盒和无内毒素质粒小量提取试剂盒购自美国0MEGA公司;Lipofectamine2000、Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司;兔抗人AQP9多克隆抗体购自美国SantaCruz公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)、油酸、油红O购自美国Sigma公司;甘油三酯(TG)检测试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司;游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;甘油含量GPO-POD酶法测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。　　2.重组质粒的构建:根据小干扰RNA的设计原则和NCBI中AQP9基因编码序列(AB008775),在256位、475位、502位和835位分别设计4条21个碱基的蛀RNA靶序列,并设计21个碱基的无关序列为阴性对照,以TTCG茎环序列形成发夹,其后为siRNA作用链的反向重复序列,3′末端加有转录终止信号TTTTTT,在5′端加入BamHI酶切位点,3′端加入HindⅢ酶切位点。经BLAST查询,确定其为特异性序列。上述5对寡核苷酸链由上海Invitrogen公司合成。将5对寡核苷酸链分别溶解在退火缓冲液中,混匀后置9s℃水浴箱5Ⅱ血,缓慢冷却至室温。限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切pGensil-1质粒,并用凝胶回收试剂盒进行纯化。将退火形成的双链短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA和纯化的pGenesil-1用T4DNA连接酶16℃连接过夜,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取经卡那霉素筛选的单菌落摇菌扩增并提取重组质粒,分别命名为pshRNA-AQP9a、pshRNA-AQP9b、pshRNA-AQP9c、pshRNA-AQP9d和pshRNA-阴性对照。　　3.重组质粒的鉴定:将提取的重组质粒与pGenesil-1进行双酶切鉴定,而后进行20g/L琼脂糖凝胶电泳。并将酶切鉴定正确的重组质粒送至重庆医科大学感染病重点实验室测序。　　4.L02细胞的培养及转染:复苏液氮冻存的L02细胞,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,置于37℃、5%CO2孵箱中培养。转染前1d,将传至第3代的L02细胞接种于6孔板上,每孔接种约7×10的5次方个细胞,待细胞达80%~90%融合度时,将无内毒素的重组质粒以脂质体Lipofectamine2000介导的方法转染L02细胞,并以pshRNA-阴性对照、pGenesil-1、重蒸水(ddH2O)及未处理L02细胞为对照,每组转染2孔(质粒与脂质体比例为1.0∶2.5),48h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。　　5.半定量PCR检测重组质粒对AQP9mRNA的沉默效果:将上述8组细胞培养48h后分别提取总RNA,各取1ugRNA反转录合成cDNA。根据NCBI中人AQP9mRNA序列设计AQP9引物,上游引物P1:5′-CTTTGGACGGATGAAATGGTT-3`,下游引物P2:5′-GAGTCAGGCTCTGGATGGTG-3′,目的基因扩增长度为546bp。同样方法设计内参照β-肌动蛋白(β-actin)引物,上游引物P3:5′-ACTGTGCCCATCTACGAGG-3′,下游引物P4:5′-GAAAHqETAACGCAACTA-3′,扩增长度为678bp,跨越2个内含子,引物由大连TaKaRa公司合成。加入AQP9引物进行PCR反应,以β-actin作为内参照,所获产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳,介凝胶成像仪拍照,QuantityOne软件分析条带灰度值。　　6.Westemblot检测重组质粒对AQP9蛋白表达的影响:将上述8组细胞培养48h后分别提取`总蛋白,取50ug蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转膜于PVDF膜上,封闭2h,以兔抗人AQP9抗体及兔抗β-actin抗体为第一抗体4℃孵育过夜,次日以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体室温孵育1h,显色、暗盒压片、显影、定影后,X光片凝胶成像仪拍照,QuantityOne软件分析条带灰度值。　　7.MTT法确定油酸诱导L02细胞脂肪变性最适作用浓度:将第3代L02细胞按每孔1×10的4次方个细胞接种于%孔板中,待细胞贴壁后加人含不同油酸浓度(0、10、20、30、40、50ug/ml)的10%胎牛血清1640培养基,每孔100ul,并设置调零孔,每组设置8个复孔,置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h后,吸弃孔内培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,加人20ulMT溶液,继续培养4h,吸弃孔内的MTT,加人150ul二甲基亚砜,室温振荡10min,酶标仪上波长选择为490nm,测定吸光度(A)值。　　8.NAFLD细胞模型建立及重组质粒转染:将第3代的L02细胞按每孔3×10的5次方个接种于6孔板中,待细胞贴壁后加人含油酸的10%胎牛血清1640培养基,继续培养72h,诱导L02细胞脂肪变性。将无内毒素的pshRNA-AQP9a转染脂肪变性的L02细胞,并以pshRNA-阴性对照、pGenesil-1、ddH2O及未处理L02细胞为对照,每组转染2孔,继续培养72h。　　9.检测重组质粒的表达:转染72h后,倒置荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白表达情况,并分别提取各组细胞的总RNA及总蛋白分别进行RT-PCR及Westernblot,检测AQP9mRNA及蛋白表达情况。　　10.油红O染色检测细胞内脂质含量:将无菌盖玻片放入24孔板中,每孔接种约6×10的4次方个L02细胞,贴壁后加人含油酸的10%胎牛血清1640培养基培养72h,脂质体介导转染无内毒素pshRNA-AQP9a,并以pshRNA-阴性对照、pGenesil-1、ddH2O及未处理L02细胞为对照,继续培养72h。吸弃孔内培养基,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定30min,5%油红O溶液染色30min,60%异丙醇洗涤30s,灭菌水洗涤30s,苏木素复染3min,灭菌水冲洗5min,中眭树胶封片,正置显微镜拍照保存。　　11.测定细胞内TG、FFA及甘油含量:将传至第3代的L02细胞以含油酸的10%胎牛血清1640培养基培养侈h,将无内毒素的pshRNA-AQP9a转染脂肪变性的L02细胞,并以pshRNA-阴性对照、pGenesil-1、ddH2O及未处理L02细胞为对照,每组转染5瓶,培养72h后,PBS洗涤细胞3次,反复冻融裂解细胞,TG检测试剂盒,FFA检测试剂盒,甘油含量GPO-POD酶法测定试剂盒分别测定各组细胞中脂质含量。　　12.统计学方法:用SPSS17.0统计软件对数据进行处理,数据以均数±标准差表示,数据比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。　　结果　　1.重组质粒的鉴定:酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示,重组质粒在392bp处有一条带,而pGenesil-1条带位于364bp处,初步说明重组质粒构建成功。测序结果显示,插入的血RNA序列未发生突变且位置正确,再次证明重组质粒构建成功。　　2.绿色荧光检测重组质粒的表达:转染48h后,重组质粒转染组和pGenesil-1转染组均可见到绿色荧光,ddH2O转染组及未处理L02细胞组未见到绿色荧光,说明重组质粒成功转染进入L02细胞中表达。　　3.半定量PCR检测重组质粒对AQP9mRNA的沉默效果:未处理L02细胞组AQP9mRNA相对表达率为39.33%±⒈69%,pshRNA-AQP9a转染组为25.10%±1.19%,pshRNA-AQP9b转染组为37.83%±⒈24%,pshRNA-AQP9c转染组为36.19%±1.93%,pshRNA-AQP9d转染组为28.47%±1.43%,pshRNA-阴性对照转染组为39.36%±1.47%,pGenesil-1转染组为39.95%±1.41%,ddH2O转染组为40.50%±1.89%,pshRNA-AQP9a转染组及pshRNA-AQP9d转染组与其他组比较,差异有统计学意义(F值分别为1.625和0.617,P值均<0.01),其中pshRNA-AQP9a更明显,初步确定pshRNA-AQP9a为沉默效果最明显的干扰质粒。　　4.Westernblot检测重组质粒对AQP9蛋白表达的影响:Westernblot检测结果显示,在相对分子质量27×10的3次方左右见一特异性AQP9条带,灰度值分析结果显示,未处理L02细胞组AQP9蛋白相对表达率为35.08%±1.89%,pshRNA-AQP9a转染组为25.41%±1.96%,pshRNA-AQP9b转染组为36.46%±1.34%,pshRNA-AQP9c转染组为33.82%±1.97%,pshRNA-AQP9d转染组为31.25%±2.57%,pshRNA-阴性对照转染组为35.59%±2.29%,pGenesil-1转染组为37.35%±2.30%,ddH2O转染组为35.85%±1.43%,pshRNA-AQP9a及pshRNA-AQP9d对APQ9蛋白表达均有抑制作用,与其他组比较,差异有统计学意义(F值分别为0.087和0.108,P值分别(0。01和<0.01和<0.05),其中pshRNA-AQP9a更明显,确定pshRNA-AQP9a为干扰效果最明显的干扰质粒。　　5.MTT法确定油酸最适浓度:油酸浓度>20ug/ml,A值显著下降,细胞活性明显降低,因此确定20ug/ml的油酸浓度作为诱导L02细胞脂肪变性的最适浓度。　　6.倒置荧光显微镜观察转染情况:转染后72h,油酸/pshRNA-AQP9a转染组、油酸/pshRNA-阴性对照转染组及油酸/pGenesil-1转染组可见绿色荧光,油酸组、油酸/ddH2O转染组、未处理L02细胞组未见绿色荧光,说明重组质粒成功转染L02细胞。　　7.RT-PCR及Westemblot检测AQP9表达:结果显示:油酸组、油酸/pshRNA-阴性对照转染组、油酸/pGenesil-1转染组及油酸/ddH2O转染组的AQP9目的条带较亮,油酸/pshRNA-AQP9a转染组条带较淡,未处理L02细胞组条带最淡。说明油酸诱导L02细胞脂肪变性能上调其AQP9lnRNA及蛋白表达,而转染pshRNAAQP9a能够降低AQP9mRNA及蛋白的表达量。　　8.油红O染色:转染72h后,油酸组、油酸/pshRNA-阴性对照转染组、油酸/pGenesil-1转染组及油酸/ddH2O转染组可见大量橘红色脂滴,伴脂滴融合现象,脂肪变性程度较重,油酸/pshRNA-AQP9a转染组可见少量橘红色脂滴,无脂滴融合现象,脂肪变性程度较轻,而未处理L02细胞组未见橘红色脂滴,表明下调NAFLD细胞模型中AQP9表达量能减轻脂肪变性程度。　　9.TG、FFA及甘油含量:未处理L02细胞组与其他组比较,TG、FFA及甘油含量差异有统计学意义(F值分别为0.007、1.430和0.509,P值均<0.01),说明油酸可诱导L02细胞脂肪变性,使其TG、FFA及甘油含量升高。油酸/pshRNA-AQP9a转染组与油酸组比较,TG、FFA及甘油含量差异有统计学意义(F值分别为0.081、0.165和0.527,P值分别<0.01、<0.05和<0.01),说明下调NAFLD细胞模型中AQP9表达量能使TG、FFA及甘油含量降低。　　讨论随着我国人民生活水平提高,NAFLD已成为常见肝病之一。不同种族、不同年龄人群均可发生NAFLD,40~49岁发病率最高。不同国家的NAFLD患病率10%~24%不等,肥胖人群患病率高达57.4%~74.0%。肝细胞脂肪变性和脂肪蓄积是整个NAFLD的起始因素,及早发现和治疗肝脏脂肪变性至关重要。　　AQP属于主要内源跬蛋白家族成员,其中AQP9不仅允许水分子通过,还允许甘油、尿素甚至某些无机离子通过,可将甘油由肝细胞外转运到肝细胞内,在调节机体的甘油运输和脂质代谢方面具有重要的意义甲。它与NAFLD、肥胖、代谢综合征及胰岛素抵抗关系密切,理解其发生机制对临床治疗具有十分重要的意义。同时,AQP9也作为一些药物吸收的通道,如化疗药物三氧化二砷。诱导肿瘤细胞膜上AQP9表达量的增加可有效提高化疗药物的疗效,并减少用药剂量,从而降低药物的不良反应,为提高肿瘤的疗效提供了一个新的思路。　　AQP9基因位于15染色体15q22,编码295个氨基酸残基蛋白,相对分子质量约为27000,主要存在于肝细胞窦状隙膜。AQP9蛋白有2个胞内环(B环和D环)和3个胞外环(A环、C环和E环)及6个跨膜转运区,羧基和氨基末端均位于细胞内,与其他的膜蛋白相同。AQP结构呈180度的对称镜像,保守的氨基酸单元为天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸,NPA是主要内源跬蛋白家族共有的特征结构。AQP的B环和E环均为疏水环,它们之间的重叠区位于脂质双分子层,形成使水、甘油和尿素的溶质分子单向通过的“滴漏模型”。　　RNA干扰作为一种新型的基因沉寂技术,已成为热点生物技术。它通过RNaseⅢ内切酶Dicer的识别、结合及酶切作用产生21~23nt的siRNA,与互补同源的mRNA序列结合并诱导其特异性降解,降低目的基因mRNA的表达。　　本研究发现将pshRNA-AQP9转染NAFLD细胞模型可使其脂肪变性程度减轻,表明降低AQP9表达量能够明显缓解及治疗NAFLD,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础。　　参考文献　　1.Hjelkrem 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