泡球蚴感染对宿主肝细胞增殖影响的初步研究

泡型包虫病是多房棘球绦虫寄生于人体及某些动物体内所致的一种严重慢性寄生虫疾病,几乎均原发于肝脏,如未经及时治疗,10年病死率高达90%。泡球蚴在中间宿主肝内以出芽的方式生长或浸润式增殖,直接破坏和取代肝实质;囊液持续渗漏可与肝组织接触,引起局部肝组织病变、增生和肝纤维化,临床常见“肝肿大”症状,晚期病灶中心发生凝固性坏死,周围的组织也因受压迫而发生萎缩、变性甚至坏死,可引起肝功能衰竭而导致肝性脑病。但有关泡球蚴在感染早、中期所致宿主“肝肿大”(伴随肝细胞增殖)的分子机制尚不清楚。本研究通过动物实验,观察泡球蚴感染对宿主肝细胞形态及细胞周期的影响,为进一步阐明泡球蚴损伤宿主肝细胞的分子机制提供理论依据。　　材料与方法　　1.实验动物与分组:8~10周龄雌性BALB/c小鼠65只(体质量18~20g),购自新疆医科大学实验动物中心。将受试动物随机分为2组:实验组40只(泡球蚴感染组),假手术组25只(等渗盐水组)。保种泡球蚴灰仓鼠购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心。　　2.主要试剂:兔抗小鼠增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclinA、cyclinB1多克隆抗体购自美国santaCruz公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔第二抗体购自美国santaCruz公司;3,3-四盐酸二氨基联苯胺显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。　　3.泡球蚴感染小鼠动物模型的建立及标本采集:将感染泡球蚴的保种灰仓鼠处死,取病灶组织,制成多房棘球绦虫原头蚴混悬液。BALB/C小鼠经乙醚麻醉,酒精消毒上腹部皮肤,开腹直视下肝叶穿刺,对照组注人等渗盐水0.1ml/只,实验组注人多房棘球绦虫原头蚴混悬液0.1,l/只。两组小鼠分别于手术后2、8、30、60、90d分5批处死,每批包括实验组8只和假手术组5只,两组均在肝左叶相同部位采集标本,取病灶(泡球蚴感染处)及病灶周围肝组织(邻近肝实质组织),10%中性甲醛液固定、石蜡包埋,4um厚连续切片备用。　　4.肝组织HE染色:用60℃烘烤30min的组织切片进行常规HE染色,观察病灶及病灶周围肝组织学变化。　　5.免疫组织化学法检测PCNA、cyclinD1、cyclinA、cyclinB1的表达及其定位:肝组织切片经脱蜡、水化、枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原后,用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次;分别加第一抗体PCNA(1∶300)、cyclinD1(1:100)、cyclinA(1∶100)、、cyclinB1(1:100),4℃孵育过夜;加入HRP标记第二抗体,37℃孵育2h;加DAB室温显色,苏木素复染,盐酸乙醇分色,梯度乙醇溶液脱水,二甲苯透明,中眭树胶封片,光学显微镜下观察。结果判定:对每例组织切片选5个高倍视野(400×),计算阳性细胞数占同类细胞的百分比;同时将免疫组织化学结果分为:阴性(-)为<10%;弱阳性(+)为10%~25%;中度阳性(++)为25~50%;较强阳性(+++)为50%~75%;强阳性(++++)为>75%。　　6.统计学方法:用SPSS17.0统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。　　结果　　1.泡球蚴感染小鼠肝组织病理学变化:假手术组肝组织结构正常,肝小叶结构完整,肝细胞边界清楚,排列整齐,无炎性细胞浸润。实验组在泡球蚴感染2、8d后可见肝细胞密集,双核细胞增多,不规则灶状坏死,汇管区炎性细胞浸润;感染30d后炎性细胞浸润和肝细胞脂肪变性增加,可见泡球蚴囊壁、肉芽肿和增生的纤维结缔组织,钙化明显,肝细胞核增大,枯否细胞增殖明显;感染60d后,炎性细胞浸润进一步加重,出现胆管增生,可见泡球蚴纤维囊壁、纤维结缔组织和炎性细胞带,肝组织内见呈簇状分布的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞,界板破坏,向小叶内伸展,少量肝细胞核增大;90d后肝脏汇管区周围发生弥漫性纤维增生、纤维化,纤维组织将若干'饲旰细胞包绕,在肝细胞之间形成纤维桥,似界板性肝炎,病灶周围炎性细胞带以中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞为主。　　2.泡球蚴感染小鼠肝脏PCNA表达的变化:免疫组织化学结果显示,假手术组肝细胞有少量PCNA的阳性表达,分布于细胞核。实验组感染2、8d时,病灶周围部分肝细胞PCNA表达阳性(表达强度“+”);感染30、60d时,病灶与肝组织间部分炎性细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等)PCNA表达阳性(表达强度“+”),病灶周围肝细胞PCNA表达比感染2、8d时明显增强(表达强度“++”);感染90d时,病灶与肝组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等)PCNA持续表达阳性(表达强度“++”),病灶周围肝细胞PCNA表达比感染30d和60d时进一步增强(表达强度“+++”)。　　3.泡球蚴感染小鼠肝组织细胞周期蛋白cyclinD1表达的变化:免疫组织化学结果显示,在2d时假手术组小鼠肝细胞有少量cyclinD1的阳性表达,分布于细胞核。实验组感染2d时,病灶与肝组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等)cyclinD1表达阳性(表达强度“++”),病灶周围部分肝细胞cyclinD1表达阳性(表达强度“++”);感染8d时,病灶周围部分肝细胞o'山1D1表达强度比感染2d有所减弱(表达强度“+”);感染30d和60d时,病灶与肝脏组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、成纤维样细胞和淋巴细胞等)cyclinD1表达阳性(表达强度“++”),病灶周围肝细胞cyclinD1表达比感染2d和8d时明显增强(表达强度“+++”);感染90d时,病灶周围肝细胞cyclinD1表达比感染30d和60d时明显减弱(表达强度“+”)。　　4.泡球蚴感染小鼠肝细胞周期蛋白cyclinA表达的变化:免疫组织化学结果显示,假手术组肝细胞cyclinA的表达均为阴性。实验组感染2d和8d时,病灶周围部分肝细胞叮洫A表达阳性(表达强度“++”);感染30d时,病灶与肝组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、成纤维样细胞和淋巴细胞等)cyclinA表达阳性(表达强度“++”),病灶周围肝细胞cyclinA表达比感染2d和8d时明显增强(表达强度“+++”);感染60d和90d时,病灶周围肝细胞cyclinA表达比感染30d时明显减弱(表达强度“+”)　　5,泡球蚴感染小鼠肝细胞周期蛋白cyclinB1表达的变化:免疫组织化学结果显示,假手术组肝细胞cyclinB1的表达均为阴性。实验组感染2d时,病灶与肝脏组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等)cyclinB1表达阳性(表达强度“++”),病灶周围部分肝细胞叮血Bl表达阳性(表达强度“+”);感染8d时,病灶周围部分肝细胞cyclinB1表达阳性(表达强度“+”);感染30d时,病灶与肝脏组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等)cyclinB1表达阳性(表达强度“++”),病灶周围肝细胞cyclinB1B表达比感染2d和8d时明显增强(表达强度“++”);感染60d和0d时,病灶与肝组织之间部分炎性细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等)cyclinB1表达阳性(表达强度“++”),病灶周围肝细胞cyclinB1表达比感染30d时明显减弱(表达强度“+”)。　　讨论　　泡球蚴寄生于肝脏并形成占位性病变是一个渐进的过程。随着持续感染,泡球蚴囊液渗漏可与肝组织接触,引起局部肝组织病变、增生和肝纤维化,直接或间接影响宿主肝脏细胞周期,导致紊乱,进而改变细胞生长分化、增殖及凋亡等进程,最终有利于泡球蚴存活、繁殖。我们前期研究结果显示,泡球蚴囊液或体外泡球蚴条件性培养液分别刺激大鼠肝脏原代细胞,可激活肝细胞丝裂原活化蛋白激酶信号通路;泡球蚴感染小鼠早、中期,也能够激活肝细胞MAPK信号通路和抑制DNA损伤基因,提示在泡球蚴感染宿主肝细胞的过程中,泡球蚴通过直接或间接刺激,激活细胞外调节蛋白激酶和Gadd45β相关信号通路来调控肝细胞周期,促进肝细胞增殖或抗凋亡同。　　本研究采用泡球蚴感染小鼠动物模型,通过显微镜观察肝组织病理学变化,发现在感染2、8、30、60d时,宿主肝脏因泡球蚴寄生、生长和侵袭,病灶周围肝细胞存在细胞核增大、双核或多核细胞增多等病理学变化。通过免疫组织化学分析结果显示,随着泡球蚴持续感染,泡球蚴病灶周围肝细胞PCNA的表达逐渐增强,病灶与肝组织间炎性细胞也有阳性表达。PCNA是反应细胞增殖活性状态的重要指标,说明体内泡球蚴感染促进宿主肝脏细胞的增殖,并对其细胞周期产生影响。　　在细胞周期中有两个主要的调控点:G1/S期限制点和G2/M期限制点。进人细胞周期的肝细胞接受许多蛋白的调节,主要包括、滥和周期蛋白依赖的蛋白激酶。在这些蛋白中,、cyclinD1是肝细胞在增殖阶段通过G1/S期限制点的关键调控因子之一,并且受到与细胞增殖相关的细胞外生长因子的调控。连接细胞信号转导和细胞周期有两条途径:一条是cyclinD/CDK4,一条是cyclinE/CDK2,都是G1期限速步骤。ERK1/2激酶诱导cyclinD1的表达,这是细胞进入S期所必需的。两条信号通路之间存在正反馈调节,从而增强ERK1/2激酶的活性。　　本研究中,泡球蚴感染2、8、30、60d时,病灶周围肝细胞cyclinDl的表达逐渐增强,病灶与肝组织之间炎性细胞也有阳性表达,感染90d时,病灶周围肝细胞cyclinD1的表达逐渐减弱,说明泡球蚴感染促进宿主肝脏细胞从G0/G1期向S期转变,启动肝细胞周期和DNA复制。CyclinA主要作用于细胞的S期,感染2、8、30d时,病灶周围肝细胞、漶A的表达逐渐增强,病灶与肝组织之间炎性细胞也有阳性表达,感染60d和90d时,病灶周围肝细胞cyclinA的表达逐渐减弱,说明泡球蚴感染促进宿主肝脏细胞进入S期,加快细胞周期的循环。cyclinB1负责细胞的G2和M期,感染2、8、30d时,病灶周围肝细胞cyclinB1的表达逐渐增强,病灶与肝组织之间炎性细胞也有阳性表达,感染60d和90d时,病灶周围肝细胞cyclinB1的表达明显减弱,说明泡球蚴感染促进宿主肝脏细胞从S期向G2和M期转变,实现一个完整的DNA复制和。细胞分裂周期循环。同时我们前期研究结果也显示,泡球蚴感染宿主可激活肝细胞ERK1/2信号通路。本研究结果提示,在感染早期(2、8、30d),泡球蚴促进宿主肝细胞增殖,通过直接刺激(囊液中的有害成分、原头蚴本身分泌的某些成分)或间接刺激(引起宿主免疫系统分泌的相关细胞因子),可能通过ERK1/2信号通路激活,进而调控cyclinD1的表达,促进细胞增殖;在感染中期(60d和90d),随着肝损伤的进一步加重,可能通过细胞周期蛋白和Gadd45β相互协调作用促进细胞抗凋亡。　　参考文献　　1.谢文娟,吕国栋,李瑶. 泡球蚴感染小鼠所致肝损伤基因表达谱的变化[J].中华实验外科杂志,2010,(2):189-191.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.02.018.　　2.Jiang CP,Don M,Jones M. 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