应用心肌自发荧光评估存活心肌线粒体氧化代谢状态

应用心肌自发荧光评估存活心肌线粒体 氧化代谢状态 程颖1,2*,任明明1,刘云奇1,Aneba S.2,Chorvat Jr. D.3,Chorvatova A.2 (1.北京大学深圳医院心血管外科,中国深圳518036; 2.蒙特利尔大学儿科学部,蒙特利尔大学圣贾斯汀医院研究中心,加拿大蒙特利尔H3T 1C5; 3.斯洛伐克国际激光中心生物光子学部,斯洛伐克伯拉第斯拉瓦81219)

摘要:目的:应用心肌自发荧光(AF)研究心肌线粒体氧化代谢状态,监测线粒体功能改变的早期信号。方法:烟酰胺腺嘌呤(磷酸)二核苷酸［NAD(P)H］作为荧光探针,用光谱分辨的时间相关单光子计数(TCSPC)记录375nm紫外激光激发的心肌AF光谱和荧光寿命,测试影响线粒体呼吸时AF动态衰减。结果:在420~560nm光谱区域,至少需用3个荧光寿命池0.4~0.7ns,1.2~1.9ns和8.0~13.0ns描述细胞AF。线粒体呼吸阻断剂鱼藤酮可显著增加AF强度,缩短平均荧光寿命。氧化磷酸化解偶联剂二硝基酚可显著降低AF强度,在520nm处增宽荧光光谱,延长平均荧光寿命。这些结果和NADH荧光动力学离体实验(in vitro)有可比性。结论:光谱分辨的荧光寿命技术测定心肌NAD(P)H荧光有很好的重复性,在细胞水平上增加了心肌氧化代谢或线粒体功能障碍的知识,为临床诊断和治疗线粒体功能障碍开拓了新视野。关键词:烟酰胺腺嘌呤(磷酸)二核苷酸;自发荧光;光谱分辨的荧光寿命;线粒体;存活心肌细胞［中图分类号］R318.51;R329.2+7［文献标志码］A［文章编号］1002-0179(2009)07-1767-05  Assessment of Mitochondrial Metabolic Oxidative State in Living Cardiomyocytes with Cardiomyocyte AutofluorescenceCHENG Ying1,2, REN Mingming1, LIU Yunqi1, et al. 1.the Department of Cardiovascular Surgery, Beijing University Shenzhen Hospital, Shenzhen Guangdong 518036, China; 2.the Department of Pediatrics, Research Centre of CHU SainteJustine, University of Montreal, Montreal, QC. Canada, H3T 1C5; 3.the Department of Biophotonics, International Laser Centre, Bratislava, Slovakia 81219Corresponding author: CHENG Ying. Email: chengying627@hotmail.comAbstract: Objective: To study fingerprinting of mitochondrial metabolic oxidative state in living cardiomyocytes with cadiomyocyte autofluorescence (AF) in order to monitor cellular fluorescence of nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate)［NAD(P)H］, the principal electron donor in mitochondrial respiration which is responsible for vital ATP supply to sensitively and reflects early signs of mitochondrial function in pathophysiological conditions, such as ischemia, diabetes and heart failure. Methods: NAD(P)H was studied as a marker for noninvasive fluorescent probing of the mitochondrial function. NAD(P)H fluorescence was recorded in living cardiomyocytes following excitation with 375nm UVlight and detection by spectrallyresolved timecorrelated single photon counting (TCSPC), based on the simultaneous measurement of the fluorescence spectra and fluorescence lifetimes. Modulation of mitochondrial respiration was tested by studying dynamic characteristics of NAD(P)H fluorescence decay in living cardiomyocytes. Results: At least a 3exponential decay model, with 0.4  0.7ns, 1.2  1.9ns and 8.0  13.0ns lifetime pools was necessary to describe cardiomyocyte AF within 420  560nm spectral range. Rotenone, the inhibitor of Complex Ⅰ of the mitochondrial respiratory chain, increased AF intensity and shortened the average fluorescence lifetime. Dinitrophenol (DNP), an uncoupling agent of the mitochondrial oxidative phosphorylation, lowered AF intensity, broadened the spectral shoulder at 520nm and increased the average fluorescence lifetime. These effects were comparable to the changes in the concentration and in the rate of dehydrogenation of NADH in vitro. Conclusion: Spectrallyresolved fluorescence lifetime technique provides promising new tool for analysis of mitochondrial NAD(P)H fluorescence with good reproducibility in living cardiomyocytes. This approach will enhance our knowledge about cardiomyocyte oxidative metabolism and/or its dysfunction at a cellular level. In the future, this approach can prove helpful in the clinical diagnosis and treatment of mitochondrial disorder.Key words: nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate); autofluorescence; spectrallyresolved fluorescence lifetimes; mitochondria; living cardiomyocyte     心脏功能活动需通过心肌线粒体合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)提供能量,还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)作为主要电子提供者在线粒体呼吸链复合体I被氧化为NAD+,合成90％的ATP。我们将NADH荧光作为监测线粒体功能的标记。荧光是监测NADH/NAD+氧化还原比例的重要工具［1,2］,研究发现紫外激光(ultraviolet,UV,λ=320~380nm)可激发心肌产生波长峰值为420~480nm的蓝色自发荧光(autofluorescence,AF),荧光主要来源于线粒体的NADH和烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)［24］。目前还无法区分两者的荧光信号,故将AF定义为NAD(P)H荧光,表示两种辅酶的合并影响。研究证实线粒体中NADH荧光产量4倍于NADPH,占80％［1,3,4］。当NAD(P)H被氧化为NAD(P)+后,即失去原有的荧光。通过NAD(P)H荧光分析,能反映NAD(P)H/NAD(P)+比例,评估细胞的能量代谢状况。     已有文献描述心肌和/或线粒体AF光谱［14］,但对NAD(P)H荧光寿命(fluorescence lifetime)的研究很少。荧光寿命不仅反映NAD(P)H构象或分子复合体的荧光分布,而且对荧光团的内部反应和周围环境敏感。我们在细胞水平上研究不同心脏工作量或病理状况下的心肌NAD(P)H荧光光谱寿命指纹,NAD(P)H/NAD(P)+改变,及影响线粒体呼吸时心肌AF动力学衰减,以便快速无创地评估心肌的氧化代谢状态。

1材料和方法 1.1存活心肌细胞模型制备:13~14周龄的大白鼠(SpragueDawley,Charles River,加拿大)断头处死,取出心脏,在Langendorff装置上逆行灌注蛋白水解酶液［含0.03mg/mL蛋白酶(type ⅩⅩⅣ,Sigma)和0.5mg/mL胶原蛋白酶(type Ⅱ,Worthington)］分离细胞［5］。操作在加拿大动物保护委员会(Canadian Council on Animal Care,CCAC)的评估下进行。心肌细胞在分离后10h内使用。显微镜下细胞显示完整棒状外形和清晰纹理,激光激惹有收缩反应,为存活细胞。1.2光谱分辨的时间相关单光子计数记录心肌细胞AF:光谱分辨的时间相关单光子计数(spectrallyresolved time correlated single photon counting,TCSPC)荧光显微技术记录心肌AF。标本在室温下(24℃±1℃)置于显微镜下。匹秒(picosecond,ps)激光二极管BDL375(Becker&Hickl,Boston Electronics,美国)发射出波长375nm,输出功率~1mW,宽度60ps,重复频率20Hz的脉冲UV激光,经二向色滤光镜合并后反射至样本,散聚焦成一个约10μmx20μm的椭圆形光斑,光斑由细胞的平均宽度(20~30μm)决定［5］。AF经标准立体二向色滤光片过滤刺激光后,由光谱曲线成像器分解,分光计用已知参考染色(如9,10diphenylanthracene,DPA)的放射峰值和水拉曼(Raman)波峰校准［6］。16通道光电倍增器(PML16,Becker&Hickl,Boston Electronics,美国)收集AF光谱和寿命数据,传输到计算机的SPC830卡(Becker&Hickl,Boston Electronics,美国)。光谱记录范围为390~680nm,分为16个18nm等距宽度的光谱通道,每一通道时间分辨为24ps。每一通道的总光子计数记录需达到500~5000,外周光线背景噪声光子计数一般为10~100。

1.3激光共聚焦显微镜记录心肌AF分布:使用共聚焦显微镜(LSM510 Zeiss,加拿大)记录心肌细胞的NADH荧光分布,用双光子777nm波长激光刺激细胞荧光,在435~485nm光谱区域记录AF图像。

1.4实验试剂:1~40μmol/L NADH和NADPH和1.0×10-6U/L或2.0×10-6U/L 2氧(代)异戊酸脱氢酶(lipoamide dehydrogenase,LipDH),使用前未再净化。鱼藤酮(rotenone,1μmol/L),二硝基酚(9,10dinitrophenol,DNP,50μmol/L),氰化钠(cyanide,4mmol/L)均购于SigmaAldrich(加拿大)。

1.5数据分析:用每一通道的总光子计数描述心肌AF稳态荧光光谱。用荧光寿命(τi)和相关振幅(ai)描述各荧光寿命池。数据为平均数±标准差(图)或标准误(图)。Origin7.0进行统计分析,比较用单因素方差分析(oneway analysis of variance,ANOVA),附加Tukey posttest检验。

2结果 2.1NAD(P)H分子荧光动力学离体实验(in vitro)

2.1.1浓度和pH依赖的NAD(P)H荧光衰减动力学:在细胞内液中测定1~40μmol/L的NADH和NADPH分子荧光。两辅酶均产生峰值为450~470nm蓝色荧光,荧光强度依赖于浓度(图1a)［7］。荧光强度与浓度间呈直线回归,NADH直线回归斜率大于NADPH,表明相同浓度下NADH荧光强度大于NADPH(图1c)。归一化处理不同浓度NADH光谱形状相同(图1b),支持同一来源。在450nm处,用3级指数衰减识别各荧光寿命池:第一荧光寿命池τ1=0.39ns±0.03ns(相关振幅a1,69.9%±3.2%),第二荧光寿命池τ2=1.5ns±0.1ns(20.5%±2.5%)和第三荧光寿命池τ3=8.1ns±0.2ns(9.8%±0.6%),荧光衰减不依赖于浓度(图1d)。比较不同pH(5.4、7.25及9.8)细胞内液的NAD(P)H荧光(数据从略),pH5.4轻微增加荧光强度,荧光寿命池无变化,显示pH对NAD(P)H荧光衰减无影响。

2.1.2NADH结合到LipDH后的荧光衰减动力学:20μmol/L NADH分别和1.0×10-6U/L或2.0×10-6U/L LipDH混合,结果1.0×10-6U/L LipDH对NADH荧光未起作用,单独LipDH无任何背景荧光(图2ab)。2.0×10-6U/L LipDH显著降低NADH荧光强度(图2a),归一化处理后光谱向红色光谱区域增宽约10nm(图2b),τ1呈减少趋势,τ2和τ3呈增加趋势。τ2在504nm处的显著增加,由1.8ns±0.2ns到2.7ns±0.4ns(P＜0.05),致平均荧光寿命(τ)增加,由1.36ns±0.06ns到1.65ns±0.06ns,衰减曲线延长(图2c)。有趣的是τ2增加在>450nm区域呈现光谱波长依赖的方式(图2d)。不同pH(5.4、7.25及9.8)细胞内液中NADH结合至LipDH的荧光(数据从略)结果类似游离NADH。

2.2存活心肌细胞中的NAD(P)H荧光

2.2.1NAD(P)H荧光在心肌细胞中的分布:激光共聚焦显微镜记录的细胞AF分布显示,NADH荧光主要分布在细胞纹理间(图3)。

2.2.2心肌细胞NAD(P)H荧光光谱和生命时间特性:心肌细胞NAD(P)H荧光显示(图4a),光谱峰值为450nm,归一化处理后光谱较NADH光谱向蓝色光谱区域移动~20nm(图4b)。在450nm处各荧光寿命池:τ1=0.7ns±0.9ns(69.3%±8.4%),τ2=2.0ns±0.4ns(27.6%±8.4%)和τ3=12.7ns±6.5ns(3.1%±1.6%)(表1)。

2.2.4影响线粒体呼吸链的试剂对心肌AF的影响:线粒体复合体Ⅰ阻断剂鱼藤酮(1μmol/L)可显著增加心肌AF强度(图5a)。归一化处理后光谱和对照一致(图5b),同为NAD(P)H分子贡献。鱼藤酮还显著缩短了τ1和τ2,趋势增加a1和减少a2。τ2的下降导致平均荧光寿命减少。氧化磷酸化解偶联剂二硝基酚(50μmol/L)加快NADH的脱氢比率,显著降低心肌AF强度(图5a)。有趣的是归一化处理后光谱显示向红色光谱区域增宽～20nm(图5b),大于NADH结合到LipDH的光谱增宽(～10nm),但形态改变有可比性。在450nm处,τ1和a3显著增加,致平均荧光寿命增加(表1)。对比鱼藤酮,二硝基酚使各荧光寿命池均显著延长(表1)。

3讨论

我们论证了:①光谱分辨的荧光寿命光谱学研究心肌NAD(P)H荧光指纹有很好的重复性;②鱼藤酮可以显著增加心肌AF荧光强度和缩短平均荧光寿命;③二硝基酚可以显著降低心肌AF荧光强度,在520nm处增宽荧光光谱并显著延长平均荧光寿命;④上述结果和NADH荧光离体实验具有可比性。

NADH分子在水溶液中存在两种构象:完全折叠的二核苷酸和半开放的腺嘌呤,荧光寿命从350ps(开放型)到760ps,混合后的荧光寿命为400~500ps［8,9］,和τ1一致,证实为游离NADH。NADH结合到辅酶后荧光寿命延长,和NADH结构改变有关。利用LipDH研究NADH脱氢证实,NADH的H+与LipDH的结合,以及与瞬间结合的NAD+和共价结合的FAD间的电荷转移,会出现不同结构NADH［10］。τ2及平均荧光寿命能敏感反应NADH结合到LipDH,而pH不影响NADH荧光。

UV激光激发的心肌细胞内源性荧光已知源于线粒体NAD(P)H［11］,激光共聚焦显微镜在435~485nm光谱区域记录由777nm双光子激光激发的细胞AF分布显示,NADH荧光主要分布在细胞纹理间,相当于线粒体位置［12］。在峰值450nm处,分析荧光至少需用3级指数衰减才能获得理想的卡方值(&chi;2<1.2)。在多数物理或化学情况下,NADH为2级指数的荧光衰减,从1ns跨越到7ns。心肌AF显现3种荧光寿命,提示至少存在3种独特的NAD(P)H荧光衰减,对应Blinova等［2］的结果,我们考虑最丰富的短时间寿命池(0.2~0.4ns)为游离NAD(P)H,中间(1~2ns)和长(3~8ns)时间成份则归于蛋白结合的NAD(P)H。多种荧光寿命可在同一区间内被测,我们选择的方法还不能完全区分各荧光成份,如报道的NAD(P)H构象(重叠或开放),NAD(P)H蛋白结合方式和结合后构象改变［810］。我们提出将来用荧光成份分析法结合线性光谱,纯粹化拆分复合NAD(P)H荧光。用该方法我们已经从共聚焦显微镜多光谱荧光图像中分离出FAD荧光［13］,和从心肌AF光谱中分离出Ca2+敏感的标记荧光［14］。多数组织的NAD(P)H荧光对比NAD(P)H分子时存在10~15nm的蓝色光谱移动［2,3］,我们的实验也确认了这一点。鱼藤酮和氰化钠是呼吸链阻断剂,鱼藤酮在复合体Ⅰ阻断NADH氧化,但FADH2在复合体Ⅱ的氧化仍能进行并产生ATP。氰化钠作用于复合体Ⅳ的细胞色素氧化酶,NADH和FADH2的氧化还原均可被阻断。因此氰化钠在增加NADH荧光的同时还降低了可见光(&lambda;=438nm)激发的FAD荧光强度［12］。对照鱼藤酮,氰化钠或氰化钠+鱼藤酮对心肌AF动力学影响无差异,说明鱼藤酮引起的NADH在心肌细胞内的积聚不受其他呼吸链脱氢酶影响。结果和在心肌细胞和肝脏线粒体一致［3,9］。鱼藤酮是研究复合体Ⅰ活性的较好选择。二硝基酚是呼吸链解偶联剂,通过携带H+穿过线粒体膜与氧化磷酸化解偶联,降低

图1.浓度依赖的NAD(P)H荧光动力学离体实验。a:1~40&mu;mol/L NADH背景校正荧光光谱;b:归一化处理后的荧光光谱;c:在光谱峰值450nm处NAD(P)H荧光强度与浓度的直线回归,两者均P<0.01;d:在450nm处5~40&mu;mol/L NADH荧光衰减曲线图2.NADH结合到LipDH后的荧光动力学离体实验。a:NADH(20&mu;mol/L)结合LipDH(1.0&times;10-6U/L或2.0&times;10-6U/L)或单独1.0&times;10-6U/L LipDH的稳态荧光光谱;b:归一化处理后荧光光谱;c:在450nm处的NADH荧光衰减曲线;d:20&mu;mol/L NADH以及结合至2.0&times;10-6U/L LipDH后的光谱分辨的第二荧光寿命(&tau;2),与20&mu;mol/L NADH组比较,*P<0.05图3.共聚焦显微镜记录的一个心肌细胞NAD(P)H荧光图像图4.光谱和时间分辨的心肌细胞NAD(P)H荧光光谱。a:归一化处理后心肌AF与NADH荧光光谱;b:光谱和时间分辨的细胞AF荧光衰减,X1:光谱分辨,X2:时间分辨,Y:荧光强度图5.干扰线粒体呼吸链的试剂对心肌AF光谱的影响。a:应用鱼藤酮和DNP后心肌稳态AF光谱与正常对照;b:归一化处理后光谱形态。与对照组比较,*P<0.05;与鱼藤酮组比较,#P<0.05    质子梯度,导致ATP合成减少并驱动NADH脱氢反应,激发NADH结合到脱氢酶而降低荧光强度和延长荧光寿命。DNP对心肌AF的影响和另一呼吸链解偶联剂FCCP(carbonylcyanideptrifluoromethoxy phenylhydrazone)具有可比性［3］。DNP导致的光谱增宽位于500~520nm处,为FAD荧光的峰值［12］,可能与NADH和FAD的氧化还原反应相关。因为单独LipDH没有出现任何的背景荧光(图3a),所以不可能是LipDH结合FAD的混合荧光。这一现象的另一解释为NADH荧光诱发了到FAD的荧光共振能量转移(Frster resonant energy transfer,FRET),因为NADH和FAD在LipDH的结合区域非常接近,NADH环的C4对齐传递H+给FAD+的N5间的平均距离为0.3nm［10］。而两荧光团之间发生FRET的有效距离为2~7nm［15］,NADH荧光峰值450nm正好为FAD荧光的刺激光波长［12］,这就具备了发生FRET的条件。但我们之前的讨论［7］由于缺乏NADH &tau;1的缩短,是否真的存在FRET还需要进一步的研究。    我们的研究证实光谱分辨的荧光光谱结合荧光寿命分析是监测心肌线粒体氧化代谢的敏感方法,可快速和重复地测定NAD(P)H复合荧光衰减,解释NADH构象改变,以及从NADH到辅酶结合的黄素蛋白的能量转移。这些研究开拓了心肌细胞生理调节NADH的新视野。在后期的研究中,我们还将进行NAD(P)H荧光成分的分离,心肌缺血,糖尿病心脏病的心肌AF指纹研究,以及应用荧光光谱指纹特征早期诊断儿童心脏移植的排斥反应的研究［16］,为诊断和治疗心肌线粒体功能障碍提供帮助。

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