2型糖尿病血管并发症患者细胞间黏附分子1基因多态性研究

　　作者：毛达勇,周有利,丁嫣　　作者单位：湖北省郧阳医学院附属太和医院，湖北 十堰

　　【摘要】目的 研究细胞间黏附分子1(ICAM1)469K>E基因多态性位点等位基因分布频率及其与2型糖尿病(T2DM)血管病变的关系。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)方法检测62例T2DM血管并发症患者ICAM1 469 KK、KE及EE基因型出现的频率。并检测其空腹血糖(BS)、甘油三酯(TG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血浆游离ICAM1(sICAM1)和总胆固醇(TC)水平，并与70例无血管并发症的T2DM患者及121例正常对照组比较。结果 KK、KE、EE 3种基因型在3组中的分布频率有明显差异(χ2=6.313，P=0.043)，DM血管病变组等位基因E的频率明显高于对照组和无血管病变组(P<0.01)，T2DM血管病变组ICAM1 469E等位基因携带者sICAM1水平明显高于K等位基因携带者(P<0.01)。结论 ICAM1 469E等位基因与DM血管病变及ICAM1水平升高有关。

　　【关键词】 2型糖尿病 血管并发症 细胞黏附分子1 基因多态性

　　血管病变是糖尿病(DM)的主要慢性并发症，其中大血管病变是DM死亡的主要原因,而微血管病变则可严重影响DM患者的生活质量〔1〕。DM血管病变的早期病理特征是内皮细胞损伤，而黏附分子可能在其发生发展过程中起着重要作用。本文通过对2型糖尿病(T2DM)伴血管并发症的患者细胞间黏附分子1(ICAM1) 469K>E基因多态性进行检测，探讨其与DM和DM血管并发症之间的内在联系。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 符合WHO1999年推荐的DM诊断标准的T2DM患者132例，男61例，女71例，年龄28～59(平均46.5)岁，病程(4.1±1.8)年，均未采用饮食治疗、口服降糖药物或胰岛素治疗。按有无血管并发症分为有并发症组62例(大血管病变定义：经临床、心电图及影像学检查证实为冠心病、脑血管病变及肢体动脉缺血性病变;微血管病变定义：经眼底检查证实为糖尿病视网膜病变或者尿微量白蛋白排泄>30 mg/24 h，并排除其他原因蛋白尿的糖尿病肾病);无并发症组70例：均未发现血管病变。正常对照组121例：为本院健康体检者，男67例，女54例;年龄31～60岁，无心、脑、肝、肾等器质性疾病。

　　1.2 试剂与仪器 血糖(BS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和糖化血红蛋白(HbA1c)检测采用英国RANDOX公司试剂，ABBOTT Aeroset自动生化分析仪(ABBOTT公司，美国);ICAM1检测采用英国R&D Systems公司酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒，酶标仪为PR 2100型(Sanofi Diagnostics Pasteur研究院，美国)。

　　1.3 标本采集 各组患者均于清晨静脉采血4 ml，取全血测HbA1c和外周血白细胞基因组DNA;分离血浆并分为2份，一份做BS、TC、TG测定，3 h内完成，另一份置-20℃冻存待测血浆游离ICAM1。

　　1.4 ICAM1基因型检测 采用碘化钠法提取外周血白细胞基因组DNA。基因型检测采用序列特异性引物PCR法，引物设计参照文献〔2〕，正向引物： 5′GGGGCTGTGGGGAGGATA3′，反向引物： 5′CCCCGACTGGACGAGAGG3′;共用引物：Sc：5′CACATTCACGGTCACCTC3′，St：5′CACATTCACGGTCACCTT3′。第一次PCR反应总体系50 μl，其中MgCl2 1.5 mmol/L，10×缓冲液5 μl，dNTP 200 μmol/L，正向引物、反向引物各25 pmol，50 ng基因组DNA，TaqDNA聚合酶0.5 U。反应条件：95℃预变性4 min，95℃变性45 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环36次，末次循环后延伸7 min，扩增产物大小分别为331及257 bp。上述扩增产物按1∶50稀释后作为模板进行第2次扩增。等位基因特异性引物反应总体系50 μl，其中MgCl2 1.5 mmol/L，10×缓冲液5 μl，dNTP 200 μmol/L，正向引物、反向引物各15 pmol，稀释模板4 μl，TaqDNA聚合酶0.5 U。反应条件：95 ℃预变性4 min，95℃变性45 s，54℃退火5 s，72℃延伸45 s，循环16次，末次循环后延伸7 min。PCR产物与载样缓冲液按5∶1在2%琼脂糖凝胶上电泳，检测扩增产物。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包，研究对象经χ2检验符合HardyWeinberg平衡，基因频率采用基因计数法计算，等位基因和基因型频率比较用χ2检验，计量资料的比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 基因型分析结果 利用等位基因特异性PCR方法扩增ICAM1第6外显子469K>E位点(产物为331 bp)，根据扩增产物进行基因型分析：若为KK型，利用引物St可扩增出237 bp产物，引物Sc无扩增产物;若为EK杂合型，引物St和Sc均可扩增出237 bp产物;若为EE纯合型，引物Sc可扩增出237 bp产物，引物St无扩增产物，电泳结果见图1。

　　2.2 3组间ICAM1不同基因型和等位基因频率比较 有并发症组ICAM1 469 KK、KE及EE基因型出现的频率与对照组相比有显著差异(χ2=6.014，P=0.049)，等位基因频率在两组人群中的分布也存在明显差异，等位基因E出现的频率明显高于对照组(χ2=6.393，P=0.015)，见表1。无并发症组各基因型及等位基因分布频率与有并发症组及对照组相比有一定的差异，但无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 T2DM伴血管并发症组不同ICAM1 469K/E等位基因临床资料的比较 有并发症组ICAM1 469K/E两种等位基因携带者BS、TG、HbA1c和TC水平无明显差异(P>0.01)，而等位基因E携带者血浆sICAM1及TG水平明显高于K携带者(P<0.01)，见表2。

　　M：marker;1：第1次PCR产物;2、3：KK基因型;4、5：KE基因型;6、7：EE基因型

　　图1 ICAM1 469K>E多态性位点巢式PCR电泳结果(略)

　　表1 各组ICAM1 469K/E基因的基因型和等位基因频率的分布(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05

　　表2 不同等位基因型患者临床资料的比较(略)

　　与K等位基因携带者比较：1)P<0.01

　　3 讨论

　　ICAM1即CD54，分子量为85～110 kD，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员之一，分布十分广泛，活化的T细胞、B细胞、胸腺细胞和树突状细胞等ICAM1的表达均明显上调。内皮细胞的ICAM1参与白细胞穿越毛细血管壁到达炎症部位的过程;ICAM1可通过增强抗原递呈细胞(APC)与T细胞的相互作用，并作为协同刺激分子参与T细胞的激活〔3〕;血浆可溶性ICAM1(sICAM1)由ICAM1的膜外段脱落而成，可以在培养基的上清液、血液以及脑脊液中测得，是一个能确切反映ICAM1表达情况的指标。DM患者由于代谢因素影响，有更多的细胞被激活产生ICAM1，表现为血浆中sICAM1增高。

　　本研究发现，ICAM 469K/E基因多态性可能与T2DM血管病变的发生有关。方差分析显示ICAM1 469KK、KE及EE基因型在3组人群中的分布频率明显不同，进一步的研究发现，E等位基因携带者ICAM1及TG水平明显高于K等位基因携带者。这提示ICAM1基因K469E多态性可能导致了Ig样区域的氨基酸序列改变，此区域可以通过调节ICAM1和LFA1的相互作用而在ICAM1活化中起重要作用，进而通过影响ICAM1基因的表达、调节血脂代谢影响血浆TG水平及ICAM1与配体的结合，进而影响ICAM1相关疾病的发生、发展及转归。Pola等〔4〕发现，缺血性脑卒中组K469E多态性与白细胞介素6(IL6) G174C多态性有协同作用，尤其是IL6基因GG基因型与ICAM1基因EE基因型共同作用，明显增加缺血性脑卒中的危险性。但是Jiang等〔5〕在研究冠心病和心肌梗死的危险因素时发现，K等位基因是决定疾病个体易感性的一个遗传因素。而Liu等〔6〕报道，在中国人冠状动脉支架置入术后再狭窄的病例中，KK基因纯合子的频率高于对照组(KK、EE和EK基因型),且在肥胖或高脂血症患者中的作用更为显著。英国的一项研究表明，无论供体或受体携带E等位基因都可减少心脏移植后免疫性疾病的发生〔7〕。由此可见，不同人群中究竟是K等位基因还是E等位基因与炎性疾病有关结果并不一致。其原因可能是由于不同种族存在不同的遗传背景，其他重要基因与此基因相互作用或连锁不平衡所致;还可能是由于研究样本量过小而导致结果出现偏倚。

　　总之，本研究提示ICAM1 K469E 基因多态性可能为T2DM血管并发症的遗传危险因素，但其是否受遗传背景的影响、是否与其他因素共同作用及如何作用等，均有待更多种族、大样本人群研究来进一步阐明。

　　【参考文献】

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　　5 Jiang H，Klein RM，Niederacher D,et al.C/T polymorphism of the intercellular adhesion molecule1 gene (exon 6，codon 469).A risk factor for coronary heart disease and myocardial infarction〔J〕.Int J Cardiol，2002;84:1717.

　　6 Liu ZP，Huo Y，Li JP,et al.Polymorphism K469E of intercellular adhesion molecule1 gene and restenosis after coronary stenting in Chinese patients〔J〕.Chin Med J，2004;117:1725.

　　7 Borozdenkova S，Smith J，Marshall S,et al.Identification of ICAM1 polymorphism that is associated with protection from transplant associated vasculopathy after cardiac transplantation〔J〕.Hum Immunol，2001;62:24755.