糖尿病血管损害

　　作者：张继业　　作者单位：

　　【关键词】 糖尿病 血管损害

　　Brownlee于2004年Banting Lecture阐述了糖尿病并发症的“统一机制学说”(A Unifying Mechanism)。这对糖尿病及其血管损害的机理有了进一步的认识。大量的临床研究表明糖尿病微血管并发症和慢性糖尿病有明确的相关性;而大血管并发症不仅和高血糖有关，还与胰岛素抵抗关系密切。“统一机制学说”认为造成糖尿病血管损害是通过醛糖还原酶(Aldose reductase)与多元醇途径(polyol pathway)、糖基化终末产物(AGEs)形成、蛋白激酶C(PKC)激活和已糖胺途径(Hexosamine pathway)四种不同的病理机制，它们都与反映上游的高糖诱导过程有关;而高糖和胰岛素抵抗相关因素(游离脂肪酸FFA)，均可造成细胞线粒体电子传递链过度产生超氧化物(superoxide)，从而造成上述四种病理机制。而且ROS(反应性氧簇)本身也可以激活AGEs、PKC、已糖胺和NFκβ(核因子κβ)等途径损害组织。这也是高糖和FFA诱导血管损伤的共同要素。

　　1 高血糖致组织损害的一般机理

　　1.1 多元醇途径增强：作为多元醇途径的关键酶醛糖还原酶(AR)，可催化还原包括葡萄糖在内的NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)依赖的多种羰基化合物(包括毒性乙醛)。AR对葡萄糖的亲合力较低，在正常血糖浓度下，此途径代谢的葡萄糖较少;但在高糖环境中，酶介生成的多元山梨醇在细胞内大量聚积，醛糖还原酶的激活，消耗大量NADPH,使NADPH降低，后者是生成细胞内抗氧化物还原型谷胱甘肽(GSH Glutathine)的辅因子。因多元醇途径增强，可激发细胞内氧化应激。动物实验和临床试验证实AR抑制剂(ARI)有益于糖尿病神经病变的恢复。

　　1.2 细胞内糖基化终末产物(AGEs Advance glycation end product)形成增加：高血糖对细胞内外AGEs的形成起重要的始动作用。AGE的生成有三个来源，即细胞内葡萄糖的自身氧化为乙二醛，葡萄糖衍生的1_氨基_1脱氧果糖的赖氨酸加合物，分解为3_脱氧葡萄糖酮醛，以及3_磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮裂解生成甲基乙二醛(丙酮醛)。细胞内AGE前体通过三种机制损伤靶细胞：首先，AGE前体修饰蛋白而导致其功能改变，重要的是这些蛋白与调控基因转录有关。其次，细胞内AGE前体扩散至细胞外，并修饰胞外基质成份，而改变基质与细胞间信号的传递，引起细胞水平的功能失调。第三，血浆蛋白被AGE前体修饰后与内皮细胞、肾小球系膜细胞和巨噬细胞的AGE受体结合，导致受体介导的ROS产生增加，分别影响这些细胞产生促炎作用，诱导与炎症、免疫和动脉粥样硬化(AS)有关的多种蛋白因子的产生，并相互影响加速血管的损害。Hammes等用AGEs抑制剂氨基胍(Aminoguanidine)可防止实验性糖尿病视网膜病变的晚期结构改变。

　　1.3 PKC的激活：高血糖可以增加第二信使DAG(二酯酰甘油)水平，诱导PKC的激活;糖尿病血管病变中，被激活的PKC主要是_β和_δ亚型，它可以抑制eNOSmRNA(内皮型一氧化氮合酶信使核糖核酸)表达，降低NO产生，增加视网膜和肾小球内皮细胞的ET_1(内皮素_1)和MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)活性，引起视网膜和肾血流的异常，以及VEGF(血管内皮生长因子)表达增加;还参与细胞外基质沉积和基底膜增厚。通过诱导肾小球系膜细胞TGF_β1(转化生长因子β1)、纤连蛋白(Fibronectin)和Ⅳ型胶原的表达，增加微血管基质蛋白的聚集。高糖诱导的PKC激活还参与了内皮细胞和血管平滑肌细胞PAI_1(纤溶酶原激活物抑制蛋白_1)的过表达，以及调节和激活各种相关的NAD(P)H氧化酶，产生ROS增加和氧化应激。PKC_β特异性抑制剂可明显降低实验性视网膜和肾小球病变，对Ⅱ型糖尿病鼠(db/db)可以缓介肾小球系膜的增殖。

　　1.4 已糖胺(Hexosamine Pathway)途径的激活：细胞内过量的葡萄糖分流入已糖胺途径，在该途径中GFAT(谷氨酰胺：果糖_6磷酸酰胺基转移酶)将6_磷酸果糖转换成6_磷酸葡糖胺(Glucosamine_6_P)，最后成UDP_N_乙酰葡糖胺(尿苷二磷酸N_乙酰葡糖胺GlcNAc)。已糖胺途径流量的增加介导高糖诱导基因转录的机制还不明确，但是在平滑肌细胞能观察到转录因子结合部位SP1调节高糖诱导的PAI_1和TGF_β1表达增加，表明N_乙酰葡糖胺对于SP1的共价修饰，可能是联系已糖胺途径激活和高糖导致PAI_1和TGF_β1基因转录变化的机制。

　　2 “统一机制”的假说

　　虽然在细胞和动物实验中，醛糖还原酶、AGE形成、PKC激活和已糖胺途径的特异性抑制剂都可以减轻糖尿病诱导的代谢异常，但尚无明显的共同要素连接这四种机制。近年来提出了高糖诱导组织损伤的共同要素(统一机制学说)，即四种不同的病理机制都反映了上游的高糖诱导过程，高糖和胰岛素抵抗相关因素(游离脂肪酸FFA)，造成线粒体(mitochondrion)电子传递链过度产生超氧化物。而ROS(反应性氧簇)本身可以激活AGEs、PKC、已糖胺和NFκβ等途径。为了证实高糖诱导电子传递链失衡产生超氧化物，作者应用UCP_1(解偶联蛋白_1)或MnSOD(锰超氧化物岐化酶)预处理培养细胞，或用Po内皮细胞(去线粒体DNA细胞)，可以防止高糖诱导ROS产生。

　　2.1 线粒体过度产生超氧化物通过抑制GAPDH(甘油醛_3_磷酸脱氢酶)，激活四类高糖诱导的组织损伤途径，见图1。当GAPDH被抑制时，糖酵介中间产物甘油醛_3_磷酸(Glyceraldehyde_3_phosphate)水平增加，激活AGE途径和PKC途径;而且在糖酵介上游中间产物果糖_6_磷酸(Fructose_6_P)也增加，随之已糖胺途径流量增加。GAPDH被抑制最后使细胞内葡萄糖浓度增加，而使多元醇途径增加。因此，GAPDH的被抑制是高糖诱导组织损伤的共同要素。作者在5mM低浓度葡萄糖培养基，用反义DNA抑制细胞内GAPDH活性，可见其AGEs的形成相当于高浓度葡萄糖(30mM)时产生的AGEs水平。

　　2.2 高糖诱发线粒体内超氧化物，抑制GAPDH的机理：激活PARP(poly(ADP_ribose)polymerase)(多聚_ADP_核糖_聚合酶)，在正常情况下，PARP在核内呈不活动形式，当DNA损伤时被激活。PARP在DNA的修复、维持基因组的完整性和在转录水平调节多种蛋白的表达有重要作用。最近发现高糖诱导的氧化和氧化应激在鼠和人的内皮细胞可导致DNA单链断裂和PARP活化。当PARP被DNA单链断裂激活后，NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)分解成烟酸和ADP_ribose(腺苷二磷酸核糖);然后PARP形成ADP_核糖多聚体，并积聚在GAPDH和其它核蛋白上。GAPDH从胞浆穿梭于细胞核内外，在DNA修复中起关键作用。高糖诱发线粒体内超氧化物增加，细胞核DNA链断裂，激活PARP，PARP修饰GAPDH,使GAPDH水平下降，减慢糖酵介和线粒体呼吸作用，致使多元醇途径激活，增加细胞内AGEs形成，活化PKC并激活NFκβ，最后已糖胺途径也被激活。Du等在内皮细胞高糖诱发线粒体ROS增加，致使DNA单链断裂并激活PARP的实验中：予先将UCP_1或MnSOD过表达，可防止高糖诱发PARP激活过程。

　　3 “统一机制”解释糖尿病大血管病变

　　UKPDS显示糖尿病微血管病变终点事件随着糖化血红蛋白(HbAlc)水平从5.5至9.5%升高，可增加将近10倍;而糖尿病大勋管病变在相同的HbAlc水平升高的范围内，其致死性和非致死性心梗仅增加2倍左右。因此高血糖并不是糖尿病大血管病变的主要决定因素。San Antonio Heart Study报告一组无糖尿病或糖耐量损害的男性人群，高度胰岛素抵抗可增加心血管病危险2.5倍。作者发现在细胞培养或动物实验胰岛素抵抗增加脂肪细胞FFA，并流入动脉内皮细胞(此现象发生在大血管而非微血管);增多的FFA流量可增加线粒体FFA氧化(包括FFAβ氧化和FFA衍生乙酰CoA进入三羧酸循环的氧化)。脂肪酸过度营养的条件下，如同高糖基质流流入三羧酸循环，线粒体生成乙酰CoA和NADH(还原型NAD)、FADH2(还原型黄素腺嘌呤二核苷酸)。(从葡萄糖通过丙酮酸或从FFA通过β氧化生成乙酰CoA与草酰乙酸结合形成柠檬酸，进入三羧酸循环转变为异柠檬酸，经由NAD+依赖的异柠檬酸脱氢酶生成NADH);当过量的NADH和FADH2不能被氧化磷酸化消散时，线粒体质子梯度增加，单电子被转移至O2生成活性O20。由FFA诱导的线粒体ROS增加，如同高糖诱导激活相似的四个损伤机制(图4)：AGEs形成增加，PKC、已糖胺途径(GlcNAc)和NFκβ激活。Brownlee报道在胰岛素抵抗而无糖尿病的动物模型，抑制由脂肪细胞释放FFA或动脉内膜FFA氧化，可防止ROS过度产生和由此造成的损害。

　　4 糖尿病血管并发症新的治疗靶点

　　4.1 转酮酶激活剂(Transketolase Activator)：用转酮酶激活剂治疗糖尿病并发症的设想是基于上述的“统一机制”。当增加线粒体超氧化物，抑制GAPDH活性，其糖酵介中间产物积聚，进入高糖损伤的四条途径。糖酵介中间产物6_磷酸果糖和3_磷酸甘油醛也是转酮酶反应的终末产物，可经转酮酶作用增加戊糖途径(Pentose Pathway)，而使上述二个糖酵介中间产物减少;这样就使已糖胺、PKC和AGE途径的作用减少，从而减轻高血糖引起的组织损伤。转酮酶的激活剂——硫胺素(Tiamine)的衍生物Benfotiamine，可在培养的动脉内皮细胞激活转酮酶，阻断高血糖损害的代谢途径。Benfotiamine治疗可完全预防糖尿病患者非增生性视网膜病变和实验性糖尿病视网病变[14]。

　　4.2 PARP抑制剂：高糖和增加FFA在线粒体可反应性增加超氧化物，激活PARP;后者可修饰和抑制GAPDH，糖酵介受阻而激活四条组织损害途径。“统一机制”学说设想：抑制PARP可阻断上述因高糖和FFA所致组织损害。Du等在培养的内皮细胞，加入一种特殊的PARP抑制剂，可防止高糖诱导PKC、NFκβ的激活，AGE形成和已糖胺途径。Brownlee等在慢性实验性糖尿病和糖尿病患者用PARP抑制剂也完全可以预防非增生性视网膜病变的结构改变和非细胞性毛细血管病变。

　　4.3 催化性抗氧化剂(Catalytic Antioxidants)：内皮性NOS和前列环素合成酶(Prostacyclin Synthase)在血管生物学中有十分重要的作用，而在糖尿病患者和实验糖尿病动物，二者被严重抑制，也是糖尿病患者大血管病变(动脉粥样硬化)的重要因素。高血糖诱导的超氧化物是一连续过程，一般的抗氧化剂无效。一种新型的催化性抗氧化剂如SOD/Catalase mimetic可防止主动脉氧化损伤，防止糖尿病主动脉eNOS和前列环素合酶的失活。

　　上述资料说明纠正糖尿病诱发超氧化物，可能是预防糖尿病并发症(大血管病变)有力的佐证。此外，噻唑烷酮类化合物(TZD)、他汀类药物、ACEI、ARB它们在不同的水平上也有细胞内抗氧化活性。

　　Brownlee的“统一机制”学说为我们开启对糖尿病及其并发症(包括大血管病变)预防和治疗新的设想和思路;由于高血糖和过多的FFA，对线粒体功能的超载，从而引发超氧化物、ROS和氧化应激。在大血管病变，并由于血管内皮细胞一氧化氮合酶脱偶联(eNOS Uncoupling)，而NO水平降低和利用减少，进而产生活性氮(RNS)，加重血管炎症反应。由此，从新的策略来寻求和研发糖尿病血管损害并发症的有效防治措施和药物，有十分重要的意义。