胰腺干细胞的分子标志及其获得途径

　　作者：吴伟全　　作者单位：广东医学院生理学教研室，广东湛江 524023) 国家自然科学基金资助项目(No.30772769);广东省科技计划2006年资助项目(No.63044

　　【摘要】 胰岛移植是目前治疗I型糖尿病的最佳方法，但供源的匮乏限制了此方法的应用。寻找胰岛细胞新来源已成为糖尿病研究的热点。胰腺干细胞的研究为糖尿病的细胞移植治疗展示了良好的应用前景。本文就胰腺干细胞的分子特征及其获得途径的研究进行综述。

　　【关键词】 胰腺干细胞;分子标志;糖尿病;综述文献

　　Edmonton方案的成功[1]，使胰岛移植成为治愈糖尿病最有希望的方法，但此方法的广泛开展仍受供体来源匮乏和免疫排斥的限制。理论上，胚胎干细胞能分化为我们希望得到的任何细胞，是一种“万能”的种子细胞;但就胰岛素分泌细胞而言，从胰腺组织得到的成体干细胞似乎更易于向具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞分化[2]，所以胰腺干细胞作为胰岛β细胞的潜在种子细胞而成为研究的热点。本文就胰腺干细胞研究的新发现进行综述。

　　1 胰腺干细胞的主要分子标志物

　　探讨胰腺干细胞的确切来源和特异性分子标志，目的在于进一步了解胰腺干细胞的生物学特性，对胰腺干细胞的分离、纯化及转型定向分化为胰岛细胞有重要意义，胰腺干细胞的移植为糖尿病的治疗开辟道路。

　　1.1 巢蛋白(nestin)

　　nestin是在神经干细胞中发现的一种中间丝蛋白,已被确认是神经干细胞的分子标志。2000年 Hunziker 等[3] 首先报道4周龄的小鼠胰岛内存在nestin阳性细胞。 他们由nestin阳性胰腺导管上皮样细胞诱导分化得到胰岛细胞的一个亚群,认为nestin是胰岛干细胞的一个分子标志物,其作用可能是促进胰腺内分泌干细胞的分化。在16d 小鼠胚胎的胰岛细胞团中nestin很丰富,并普遍存在于60 d 小鼠的胰岛和胰腺导管，且nestin阳性的细胞在体外培养8个月后仍具有增生能力。最近，Kedees等[4]根据胰高血糖素信号能控制nestin的表达的原理，通过分析小鼠胰腺上皮祖细胞和胰腺外分泌细胞的胰高血糖素信号，结合免疫组织化学染色和mRNA检测，最终确定nestin确实在胰腺上皮细胞中表达，认为nestin可以作为胰腺干细胞的标志物。Bernardo等[5]通过用增强绿色荧光蛋白技术(EGFP)结合免疫组织化学染色方法和RTPCR技术来分析转基因小鼠nestin阳性胰岛细胞，结果显示nestin阳性胰岛细胞具有多向分化的潜能，体外培养条件下可分化为胰腺内、外分泌细胞。说明胰岛nestin阳性细胞是胰腺干细胞，nestin是胰腺干细胞的重要分子标志物。

　　1.2 胰腺十二指肠同源盒1(PDX1)

　　人PDX1蛋白由283个氨基酸组成,相对分子质量为31×103D。 在成年胰腺组织中，PDX1仅存在于胰岛中分泌胰岛素的B细胞和分泌生长抑素的D细胞上。在胚胎发育过程中，PDX1最早在e9.5时即出现于原肠胚胰芽萌生处，继而胰芽萌出，发育成胰腺。PDX1纯合缺陷的小鼠胚胎不能形成胰腺组织，杂合缺陷小鼠出生后将发展为糖尿病。在胰岛再生过程中，总是先有PDX1的表达，再有胰岛的新生。在胰腺发育的早期，胰腺内、外分泌细胞上均有PDX1表达。发育成熟后，PDX1仅在胰岛B细胞和D细胞中出现[6]。在胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导过程中也发现，在胚胎干细胞阶段和分化的早期(拟胚体)阶段均无PDX1的表达。经过特异性诱导之后，出现PDX1的表达，然后有胰岛素分泌细胞出现[7]。在胰腺导管上皮细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导过程中，也是先有PDX1表达，再有胰岛素分泌细胞出现[8]。因此，PDX1是胰腺干/祖细胞的特征性标志之一。

　　1.3 细胞角蛋白19(CK19)

　　CK19是细胞角蛋白的片段，是上皮细胞骨架的一种中间丝状物，是一种酸性蛋白。在胰腺发育过程中，胰腺内分泌细胞来源于角蛋白阳性的内胚层上皮细胞，有高水平的角蛋白表达。Feng等[9]从胎猪胰岛获得导管上皮细胞中分离得到表达CK19的细胞，其体外的生长行为有类似胚胎干细胞样生长形态，细胞体外增殖活力很强，现已传至18代，细胞经诱导后分化为分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞，并且伴随着细胞超微结构的改变。最近，Chen等[10]通过研究证明人的胰腺导管上皮细胞表达CK19阳性，是胰腺干细胞的主要来源，并证实这种CK19阳性细胞能诱导分化为胰腺的内分泌细胞。因此表明CK19也是胰腺干细胞的重要分子标志。

　　1.4 ABCG2

　　ABCG2是ABC转运蛋白(ATPbinding cassette transporter)家族成员ABCG2/Bcrpl。这种蛋白的功能目前还不清楚，但有人认为可能属于细胞膜上的泵蛋白，和多药耐药基因MDR相似。膜上表达ABCG2的细胞能够把进入细胞的荧光染料hoechst33342泵出细胞，使细胞内的核酸不被染色，细胞呈现微弱的兰色荧光。在流式细胞仪检测时，这些细分布于主要细胞的一侧，因而被称为侧群细胞(side population, SP细胞)。SP细胞最早在作造血干细胞研究时被发现，后来发现包括肿瘤在内的多种组织中都有SP细胞，是一类原始幼稚的未分化细胞[11]。来源于胰腺的SP细胞具有形成胰岛样细胞团的能力，也可以视为胰腺干细胞。但ABCG2不仅限于在胰腺组织中表达，可能是所有干细胞共有的一个“通用标志”[12]。我们正在进行的实验发现，从人胚胎胰腺得到的细胞经过纯化扩增后，在流式细胞仪检测时86%以上的细胞都可以表达ABCG2。这些细胞有很强的增殖能力，在体外能被诱导形成具有胰岛素分泌功能的类胰岛样结构——胰岛样细胞团(资料待发表)。

　　1.5 胰腺干细胞的其它分子标志物

　　已知胰腺干细胞的标志物还有神经元蛋白3(Ngn3)、波形蛋白(Vimentin)等[1314]，也许还有很多的标志物尚未被发现，筛选胰腺干细胞的标志物的新方法也还在不断探索之中。由于胰腺干细胞标志物的多样性，在确定胰腺干细胞时,需多种标志物综合考虑才能确定。

　　2 胰腺干细胞的获得

　　作为一种存在于已分化组织中的成体干细胞，自然状态下的胰腺干细胞只存在于胰腺组织，主要是胰腺导管、胰岛以及胰腺腺泡中。由于干细胞的多向分化特性，在特定情况下其他组织的多能干细胞也可能“转分化(transdiffetentiation)”为胰腺干细胞。因此，获得胰腺干细胞的方法主要是从胰腺组织中分离或从其他多能干细胞“转分化”而来。

　　2.1 胰腺导管

　　绝大多数研究者认为，胰腺干细胞存在于胰腺的导管中。Ramiya等[15]最先报道从分离的小鼠胰腺导管培养中获得了胰腺干细胞，在体外培养条件下传代了3 a。该细胞可培养分化为胰岛样细胞团，将该细胞团移植到NOD鼠(nonobese diabetic mice,非肥胖型糖尿病鼠)可显著降低其血糖，能够逆转NOD鼠的糖尿病症状。最近，乔海等[16] 从胎儿胰腺中采用胶原酶消化法分离出胰岛样细胞团(ICCs)，并对其进行贴壁培养，从中纯化分离出具有自我更新能力的上皮样细胞,为导管来源, 免疫组织化学染色显示其表达胰十二指肠同源异型盒基因1 (PDX1)、CK19、神经Nestin，不表达胰岛素，具胰腺干细胞特性。

　　2.2 胰岛

　　胰腺干细胞存在于胰岛本身越来越受研究者关注。Yang等[17]从大鼠胰腺中采用胶原酶V消化法分离出胰岛样细胞团，根据胰岛细胞的纯度分为3个等级组，A为低等级(43.60±6.29)%，B为中等级(65.30±4.40)%，C为高等级(77.60±6.36)%。然后提取细胞RNA，再进行RTPCR测定细胞的CK19和PDX1的表达，结果显示不同纯度的胰岛中均有CK19及PDX1蛋白和mRNA的表达,表明在纯化胰岛中均有胰腺干细胞存在。

　　2.3 胰腺腺泡

　　有些研究者认为胰腺干细胞也可能存在于胰腺腺泡中。Ku等[18] 报道胰腺腺泡中也存在胰腺干细胞，虽然数量较少，但其诱导后产生β细胞的比例高于导管中的胰腺干细胞，在葡萄糖刺激反应中分泌胰岛素的量更大。

　　2.4 多能干细胞的“转分化”

　　胚胎干细胞(ESC)和胚胎生殖嵴干细胞(EGC)是目前发现的具有“全能性”的干细胞。自2000年有胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞(insulin producing cell,IPC)的报道以后，ESC在糖尿病治疗中的研究一直是干细胞研究的热点。我们也成功将ESC诱导成了IPC，优化了实验条件，简化了实验方法，缩短了诱导时间，在STZ诱导的糖尿病小鼠的实验性治疗中取得了初步疗效。但所能获得的IPC数量太少，胰岛素分泌功能差是目前存在的主要问题[19]。EGC是从胚胎内胚层迁移到胚胎生殖嵴中的原始细胞，保留了与ESC相似的“全能性”，可以分化为肝细胞、心肌细胞、血细胞、神经细胞等多种组织细胞，但目前还没有EGC分化为IPC的报道。

　　骨髓间充质干细胞在体外诱导情况下可以分化为IPC。由于骨髓间充质干细胞相对容易获得，其最大优势还在于取自自身的骨髓间充质干细胞用于自体移植时可消除免疫排斥这个器官移植的最大难题，因而骨髓间充质干细胞被认为是最有应用前景的IPC来源[20]。

　　十二指肠、空肠上段组织中的“K”细胞在体外有很强的增殖分化能力，也可以转分化为IPC[21]。在某些情况下，肝脏组织中可以看到胰腺组织的“化生”现象，说明肝脏中也有能分化为胰腺组织的细胞。在胚胎发育上，肝脏、胰腺和小肠的同源性很高。因此，从理论上来说，这些组织中残留的干细胞是最有可能转分化为胰腺组织的，但目前为止尚未看到从肝、肠干细胞转分化为IPC的报道。

　　3 胰腺干细胞的分离及纯化

　　胰腺干细胞的分离及纯化方法主要包括：(1)胶原酶解离法(多用V型胶原酶)结合密度梯度离心分离技术;(2)离解组织法：包括机械分离法(组织研磨、过滤等)与酶分解法;(3)利用细胞表面的分子标志分离纯化，包括免疫溶解法、流式细胞结合荧光激活细胞分选术(FACS)、平面黏附分离法及免疫磁珠分选技术。

　　3.1 胶原酶解离结合密度梯度离心分离技术法

　　在酶学方法解离的方法中，常用的技术包括用胰蛋白酶消化、胶原酶消化等。用酶学方法到达部分分离纯化的主要依据是不同的组织的细胞和间质的构成不同。而利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。其基本原理是，在离心力的作用下，细胞在一定介质中的沉降速率与细胞的体积及细胞密度和其周围介质密度之差成正比。细胞的体积越大，其与分离介质的密度差越大，则细胞的沉降速率就越快。对与特定的待分离细胞来说，其体积和密度是固定的，可以选择的只是具有一定密度与黏度的分离介质。使之沉降的细胞密度应该比介质大，而使之漂浮的细胞的密度则应比介质小。因此，实施沉降技术分离细胞的关键在于选择密度梯度形成介质，故沉降技术也称为密度梯度离心技术。陈维平等[22] 用V型胶原酶消化小鼠胰腺组织( 湿重), 结合自然沉降技术形成不连续密度梯度离心。分别从磷酸盐缓冲液/1.068 g/L Percoll液(第一界面)、1.068 g/L Percoll 液/1.096 g/L Percoll液(第二界面)、1.096 g/L Percoll液/1.118 g/L Percoll液(第三界面) 收集细胞。各界面细胞均加入含体积分数为0.1 胎牛血清的DMEM低糖培养基, 置于经多聚赖氨酸处理的培养瓶中常规培养。最终从胰腺内、外分泌部的组织中能成功获取胰腺干细胞特异性标志Nestin表达阳性的干样细胞。最近，Noguchi等[23] 采用胶原酶消化小鼠胰腺组织,结合自然沉降技术形成不连续密度梯度离心，经过双硫腙染色技术和在显微镜下将消化后的胰岛细胞从多种细胞悬液中挑出来，剩余的细胞继续培养及诱导分化，最终可以得到分泌胰岛素的细胞。因此，这种方法可以认为是一种很好的分离胰腺干细胞的方法。

　　3.2 离解组织法

　　机械分离与酶学解离是将组织分散成单细胞常用的方法。王贝斌等[24]无菌采集胎猪胰腺, 置于预冷的PBS中冲洗并除去周围的脂肪、筋膜等,后剪为组织块,加入两倍体积的胰酶,于37 ℃消化10 min。期间不时振荡,终止消化后过200目筛网,离心,并清洗2次。细胞接种于12孔板, 加入培养液(RPMI 1640加入10% FBS、丙酮酸钠、β巯基乙醇、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、青链霉素),置于37℃,95%空气,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养。其实验方法主要将收集的胰腺经胰酶消化筛网后直接接种于培养板,免去了以往的利用密度梯度离心分段收集不同细胞的繁琐程序，同样获得了可以多次传代的胰腺干细胞, 用该方法已获得4株猪胰腺干细胞。

　　3.3 其它利用细胞表面的分子标志分离纯化的方法

　　流式细胞仪(FCM)是一种将流体喷射技术、激光技术、空气技术、射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的仪器。流式细胞技术(flow cytometry)就是应用FCM检测、分析生物颗粒(包括细胞)的物理和(或)化学特性或借助这些特性进行分离纯化的技术。分选细胞为流式细胞术应用的一个重要方面，它是用FCM将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得高纯度的细胞制剂，以进行有关活细胞的特性及其功能的各种研究。用荧光染料分离细胞的流式细胞仪也称荧光激活的细胞分选术(FACS)。最近，Lin等[25] 从成年人胰腺导管组织中分离纯化得到细胞后，对该细胞的细胞表面分子标志物PDX1和Nestin进行荧光染色，即以荧光抗体与细胞表面标志结合，然后用FCM进行分选。最终分离出PDX1和Nestin表达阳性，具有胰腺干细胞的特性的细胞。

　　4 胰腺干细胞研究存在的问题与展望

　　胰腺干细胞的研究起步较晚，但近年来进展迅速。将ESC、骨髓间充质干细胞等在体外诱导分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团试用于糖尿病的实验性治疗，为糖尿病的干细胞治疗展现了良好的运用前景。可以预见，除基因治疗之外，干细胞移植治疗最可能获得突破的就是内分泌疾病，其中受益最大的将是发病日益增多的糖尿病。但从目前情况看，糖尿病的干细胞治疗从基础走向临床，还有相当长的路要走。主要问题是：(1)ESC直接用于移植将会形成畸胎瘤。先在体外将其诱导分化为具有胰岛素分泌功能的IPC后用于移植，可以避免肿瘤形成。但IPC是功能成熟的细胞，其寿命必定是有限的。当这些移植的IPC“寿终正寝”之时，也将是疗效消失怠尽之日。这显然有悖于我们的初衷。目前为止还没有人系统全面地观察IPC移植后在受者体内的排斥、存活、增殖和分化情况，因而干细胞治疗的有效性和安全性都还有待证实。(2)从胰腺外组织的干细胞诱导分化来的IPC，其胰岛素分泌功能较差，仅大约相当于正常胰岛β细胞的1/50左右，还难于一次性获得足够数量的可供移植用的IPC。由于这些IPC数量少、功能差，因而难当大任，疗效有限。(3)IPC的诱导方法复杂，诱导时间长(4～5周)，成本高，效率低。长时间的体外操作更增加了结果的不确定性。(4)来源于异体组织的干细胞分化来的IPC用于移植，依然存在器官移植的最大难题——移植排斥。与普通的器官移植不同的是，常用的抗排异药物对IPC有毒性作用，不能长期运用，否则IPC将出现药物累积中毒。因此，IPC的抗移植排斥问题比其他器官移植更复杂。(5)胰腺不像骨髓那样易于再生、易于获得，胰腺干细胞来源严重匮乏，这是制约其临床运用的最大问题。如何寻找可替代的胰腺干细胞来源，是目前最为紧迫的问题。(6)目前对胰腺干细胞的特征性标志、增殖分化潜能、体内存活情况、移植排斥等情况都了解不多，难于有效地纯化扩增胰腺干细胞。从目前资料来看，胰腺组织来源的干细胞诱导生成的IPC，其胰岛素分泌功能比非胰腺来源者好，应用价值更大。但正常情况下没有获得胰腺组织的可能性。从流产胚胎获得胰腺干细胞是目前唯一途径。这除了数量有限外，伦理问题是最大障碍。即使能够获得，胚胎期几克重的胰腺组织中存在的少量胰腺干细胞，对于等待移植的成年个体来说，简直就是杯水车薪。如何有效分离纯化、大规模体外扩增这些稀有的种子细胞，是稀缺资源有效利用的最佳途径。

　　2006年，诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)的发现[26]，为干细胞的应用带来曙光。除了传统领域的干细胞“转分化(transdifferentiation)”和利用核移植技术使细胞“重编程(reprogramed)”外，成熟细胞“去分化(didefferentiation)”技术能使成熟细胞“返老还童”，成为有多向分化能力的干细胞。这项技术的出现，不但能克服伦理限制，还能克服组织工程种子细胞来源匮乏和移植排斥几大难题，是再生医学的希望之光。随着iPS技术的成熟完善和胰腺干细胞研究的深入，在特定组织细胞内导入控制IPC分化的基因，使这些细胞向IPC分化以替代病损的胰岛细胞，将可能使糖尿病这个严重危害人类健康的顽症彻底治愈。

　　【参考文献】

　　[1] Shapiro A M, Lakey J R, Ryan E A,et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoidfree immunosuppressive regimen[J]. The New England Journal of Medicine, 2000, 343(4):230238.

　　[2] Madsen O D. Pancreas phylogeny and ontogeny in relation to a‘pancreatic stem cell'[J].C R Biol, 2007, 330(67):534537.

　　[3] Hunziker E, Stein M. Nestinexpressing cells in the pancreatic islet of Langerhans[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 271 (1) :116119.

　　[4] Kedees M H, Guz Y, Vuguin P M, et al. Nestin expression in pancreatic endocrine and exocrine cells of mice lacking glucagon signaling[J].Dev Dyn, 2007,236(4)：11261133.

　　[5] Bernardo A S, Barrow J, Hay C W, et al. Presence of endocrine and exocrine markers in EGFPpositive cells from the developing pancreas of a nestin/EGFP mouse[J]. Mol Cell Endocrinol, 2006, 253(1): 1421.

　　[6] 周光纪，徐海伟，屈纪富.胰腺的发育及相关基因调控[J]. 胰腺病学，2006, 6(5):303306.

　　[7] Lin H T, Kao C L, Lee K H, et al. Enhancement of insulinproducing cell differentiation from embryonic stem cells using pax4nucleofection method[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(11):16721679.

　　[8] Ueda M, Matsumoto S, Hayashi S, et al.Cell surface heparan sulfate proteoglycans mediate the internalization of PDX1 protein[J]. Cell Transplant, 2008,17(12):9197.

　　[9] Feng R P, Zhang H R, Wang Y, et al. Isolation, Culture and induced differentiation of fetal porcine islet derived pancreatic stem cell[J]. Agr Sci China, 2007, 6(6): 742748.

　　[10] Chen B, Wang L, Hu S, et al. Would pancreas ductepitheliumderived stem/progenitor cells enhance islet allograft survival by means of islets recruitment and tolerance induction in Edmonton protocol era[J]? Med Hypotheses, 2008, 70(3): 661664.

　　[11] Zhou J, Wang C Y, Liu T, et al. Persistence of side population cells with high drug efflux capacity in pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(6):925930.

　　[12] Fetsch P A, Abati A, Litman T, et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistanceassociated protein in normal tissues[J]. Cancer Lett, 2006, 235(1): 8492.

　　[13] Kim S Y, Lee S, Min B H, et al. Functional association of the morphogenic factors with the clusterin for the pancreatic betacell differentiation[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2007, 77 (l1) :122126.

　　[14] Yang M, Liu W, Wang C Y, et al. Proteomic analysis of differential protein expression in early process of pancreatic regeneration in pancreatectomized rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(5): 568578.

　　[15] Ramiya V K, Maraist M, Arfors K E, et al. Reversal of insulindependent diabetes using islet generated in vitro from pancreatic stem cells [J]. Nature Med, 2000，6(3): 278282.

　　[16] 乔海,赵婷,杨春荣,等.胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离、纯化和鉴定[J]. 生物工程学报, 2007, 23(2):246251.

　　[17] Yang C, Wang J M, Du C Y, et al. Expression of stem cell markers CK19 and PDX1 mRNA in pancreatic islet samples of different purity from rats[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2007, 6(5):544548.

　　[18] Ku H T, Zhang N, Kubo A , et al . Committing embryonic stem cell s to early endocrine pancreas in vitro[J]. Stem Cells,2004,22(7) :12051217.

　　[19] 周光纪,徐海伟,屈纪富,等.神经前体细胞不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必经途径[J]. 生物医学工程学杂志,2007，24(6)：13251329.

　　[20] Sun Y, Chen L, Hou X G, et al. Differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cells from diabetic patients into insulinproducing cells in vitro[J]. Chin Med J (Engl), 2007, 120(9):771776.

　　[21] Han J, Lee H H, Kwon H, et al. Engineered enteroendocrine cells secrete insulin in response to glucose and reverse hyperglycemia in diabetic mice[J]. Mol Ther, 2007, 15(6):11951202.

　　[22] 陈维平,岑妍慧,叶健,等.昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特异性标志物巢蛋白的鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(7):12821284.

　　[23] Noguchi H, Matsumoto S, Ueda M, et al. Method for isolation of mouse pancreatic stem cells[J]. Transplant Proc, 2008, 40(2) :422423.

　　[24] 王贝斌,赵婷,乔海,等.胎猪胰腺干细胞的分离与鉴定[J].农业生物技术学报, 2007,15 (4):622627.

　　[25] Lin H T, Chiou S H, Kao C L, et al. Characterization of pancreatic stem cells derived from adult human pancreas ducts by fluorescence activated cell sorting[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(28): 45294535.

　　[26] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006, 126(4):663676.