全反式维甲酸对糖尿病肾病肾小球pcadherin表达的影响

　　作者：刘声茂 许钟镐 徐 锋 王林华 张冬梅 郭桥艳 刘庆鑫 苗里宁 作者单位：吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 观察全反式维甲酸(ATRA)对糖尿病肾病(DN)肾小球pcadherin表达的影响,明确其对肾脏的保护作用。方法 应用链脲佐菌素(STZ)建立DN大鼠模型。ATRA治疗组(n=10)给予ATRA每天20 mg/kg灌胃，对照组(C组,n=10)、DN组(n=10)以等量蒸馏水灌胃。采用ELISA法检测大鼠24 h尿液中白蛋白及肌酐值;免疫组织化学和胶体金免疫电镜法观察pcadherin蛋白表达的部位及数量;RTPCR法检测pcadherin mRNA表达。 结果 ATRA组肾重及尿白蛋白/尿肌酐比值较DN组明显下降(P<0.01)。免疫组化检测结果示ATRA组pcadherin蛋白表达较DN组上调，与C组相比无明显下降。电镜结果示DN组免疫金染色的pcadherin蛋白较C组减少。RTPCR结果示ATRA组pcadherin mRNA表达较DN组上调，与C组无明显差异。结论 ATRA可逆转DN大鼠早期DN肾小球足细胞pcadherin蛋白的下调，由此降低早期DN尿白蛋白排泄量，延缓DN进展。

　　【关键词】 全反式维甲酸 糖尿病肾病 p cadherin

　　Effect of alltrans retinoic acid on glomerular pcadherin expression in diabetic nephropathy

　　LIU ShengMao,XU ZhongGao，XU Feng，et al.

　　Department of Nephrology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective By investigating the effect of alltrans retinoic acid (ATRA) on the expression of glomerular pcadherin in diabetic nephropathy (DN) for its protective role in kidney. Methods Diabetes mellitus model was established by intraperitoneal injection of STZ. 30 rats were randomly and averagely divided into DN model, DN+ATRA (20 mg·kg-1·d-1 by intragastric administration) and normal control (equivalent distilled water by intragastric administration) groups. 24 h urine albumin (Ualb) and urine creatinine (Ucr) were assessed by ELISA. Kidney histopathological changes by PAS staining were observed under light microscopy. Pcadherin expression in the kidney tissues was detected by immunohistochemistry. Colloidal gold immune electron microscopy was used to observe the location and quantity of pcadherin expression in podocyte. RTPCR was used to detect pcadherin mRNA expression. Results UAlb/UCr in DN+ATRA group decreased significantly compared with that of DN group (P<0.01). The expression of pcadherin protein in DN+ATRA group was upregulated compared with that of DN group,but there was no obvious difference between DN+ATRA group and normal control group. Electron microscope results showed that pcadherin protein expression stained by immuno gold was lessen than that of normal control group. RTPCR results showed DN+ATRA group had upregulated pcadherin mRNA expression than DN group, but there was no obvious difference between DN+ATRA group and normal control group. Conclusions ATRA can reverse the downregulation of podocyte pcadherin protein in renal glomerulus of early DN rats, reducing Ualb excretion and delaying DN development.

　　【Key words】 Alltrans retinoic acid; Diabetic nephropathy; pcadherin

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是引起终末期肾衰的重要原因。蛋白尿作为DN的特征性临床表现，其排出量的多少预示着病情的严重程度〔1，2〕。最近的研究证实分化诱导剂——全反式维甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)可以抑制免疫介导的肾炎动物模型蛋白尿的形成〔3，4〕。国外研究采用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病动物观察ATRA的效果，发现它在心脏和视网膜具有抗氧化的作用，在皮肤具有改善其结构和功能的作用〔5～7〕。但ATRA在DN治疗中的应用，尤其是在治疗蛋白尿方面尚无详细的报道。DN时肾小球足细胞裂孔膜的破坏与蛋白尿的生成有着密切的关系，肾小球足细胞裂孔膜跨膜蛋白pcadherin的表达下降与蛋白尿的形成有直接的关系〔8〕。本实验旨在探讨肾小球足细胞裂孔膜跨膜蛋白pcadherin在早期DN时的表达变化及ATRA的干预作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 ATRA(山东良福制药有限公司),STZ(美国Sigma公司)，pcadherin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),辣根酶标记羊抗兔IgG (美国Santa Cruz公司),聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(美国Milipore公司),二抗胶体金颗粒标记的羊抗兔抗体(美国Santa Cruz公司),DAB显色试剂盒(武汉博士德公司),三羟甲基氨基甲烷(Tris)(天津市华东试剂厂),尿白蛋白ELISA试剂盒(上海德波生物技术有限公司),Trizol(美国Invitrogen公司),RT试剂盒、Taq DNA聚合酶 和dNTPs (美国Femrentas公司),100 bp DNA Ladder和5×TBE (北京鼎国生物技术发展中心)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备及标本留取 成年雄性Wistar大鼠30只，体重(200±20)g，购自吉林大学基础医学院动物中心。随机取10只大鼠作为正常对照组(C组，n=10)，其余20只大鼠一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，制备糖尿病(DM)模型，48 h后大鼠随机血糖高于16.7 mmol/L，DM模型成功。将20只大鼠随机分成2组：糖尿病肾病组(DN组，n=10)和DN+ATRA治疗组(ATRA组，n=10)。给予ATRA组大鼠ATRA每天20 mg/kg灌胃，C组、DN组以等量蒸馏水灌胃。实验开始及第4周结束时称体重(BW)，尾静脉采血，血糖仪测外周血血糖(BG)。于第4周时将大鼠放入代谢笼准确收集24 h尿液，然后处死大鼠，心脏取血，离心(3 000 r/min，10 min)后吸取上清液，-70℃保存。处死大鼠取右肾称重，经肾门冠状面取组织，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切2 μm厚片做普通肾脏病理，行PAS染色及免疫组织化学染色。取左肾皮髓交界处皮质1 mm×1 mm×1 mm大小之肾组织数小块，以2.5%戊二醛固定用于电镜检测，取左肾分离皮质后速冻于液氮中封存用于RTPCR检测。

　　1.2.2 生化指标检测及计算 ELISA试剂盒测定尿白蛋白(UAlb)、尿肌酐(UCr)，并计算尿白蛋白/尿肌酐(UAlb/UCr)比值。

　　1.2.3 肾脏病理(PAS染色) 常规石蜡切片脱蜡至水。1%过碘酸染色15 min，蒸馏水洗去过碘酸。Schiff试剂反应20 min。0.5%亚硫酸钠处理2 min×3次，流水洗5～10 min。哈氏苏木素复染细胞核5 min，自来水冲洗。1%盐酸酒精分化数秒，自来水至蒸馏水冲洗。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察肾小球体积大小、系膜细胞及细胞外基质、基底膜，以及肾小球毛细血管开放等情况。

　　1.2.4 免疫组织化学染色(SP法) 常规石蜡包埋，切片厚2 μm脱蜡至水。含3%H2O2的甲醇室温孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶。微波修复抗原，然后加入1∶100稀释的兔抗鼠多克隆抗体，置湿盒中4℃过夜。加1∶100稀释生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育25 min。行DAB显色，镜下控制反应时间5 min，阳性细胞于肾小球基底膜处出现棕黄色颗粒，苏木素轻度复染细胞核。脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照以0.01 mol/L PBS代替一抗。光镜观察肾组织中pcadherin的表达情况，肾小球基底膜处棕褐色颗粒为阳性。

　　1.2.5 免疫电镜 2.5%戊二醛固定，梯度酒精脱水，氧化丙烯和Epon12工作液对组织进行渗透。Epon12固化块逐渐加高温度(不超过60℃)使之聚合变硬。先用切片机制成1 μm的半薄切片，以0.5%美兰溶液染5 min，在光镜下选取病变处，用超薄切片机制成50～60 nm的超薄切片。在室温下滴加未标记的一抗(pcadherin多克隆抗体)后放4℃冰箱过夜。PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。滴加胶体金颗粒标记的羊抗兔抗体，并置室温下1 h。 PBS缓冲液漂洗3次，每次3 min。 5%醋酸铀水溶液染色，水洗。枸橼酸铅染色。封片，镜检，摄相。

　　1.2.6 逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 按试剂盒说明提取大鼠肾组织总RNA。本实验所提总RNA经紫外分光光度计测定纯度及浓度，样品A260/A280的比值在1.7～2.0之间。用RTPCR方法对目的基因进行扩增。逆转录10 μl体系含总RNA 2 μl(0.5 μg/μl)，随机引物、DEPC水7 μl加入0.2 ml PCR反应管中，短暂离心后置于70℃反应5 min，冰上骤冷30 s，短暂离心;再加入10 mmol/L dNTP Mix 2 μl，5×RT缓冲液4 μl ，20 U/μl MMuLV逆转录酶1 μl，DEPC水3 μl，至总体积20 μl，置PCR仪上42℃孵育1 h，70℃变性10 min;冰上冷却10 min，将合成好的cDNA放入-70℃冰箱保存备用。PCR引物上游为5′GACAAGATGGTGAAGGTCGG3′，下游为5′CATGGACTGTGGTCATGAGC3′;大鼠pcadherin(397 bp)引物上游为5′CTTACAATGGGGTGGTGG3′，下游为5′GCCACGGTGAAATGATCC3′(瑞晶生物技术有限公司)。PCR仪反应参数设置为94℃预变性2 min，94℃变性30 s，58℃退火5 s，72℃延伸40 s，72℃终末延伸5 min,共30个循环，4℃保存。阴性对照为缺少cDNA。PCR产物点样于2.0%的琼脂糖上，电泳30 min后在紫外灯下观察结果。将电泳后的凝胶放于Bandscan5.0图像处理系统获得各自产物的光密度;目的基因光密度与内参照GAPDH光密度比值为目的基因的mRNA半定量值，即得出pcadherin mRNA的半定量值。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，两组间比较采用t检验,两组以上比较采用ANOVA检验。

　　2 结 果

　　2.1 三组大鼠BG、BW、右肾重(KW)、肾重/体重(KW/BW)、UAlb/UCr变化 与C组比较，DN组大鼠BG升高、BW下降、KW及KW/BW比值明显增加，UATb/UCr比值升高，各项指标均存在显著变化(均P<0.01);治疗组大鼠经ATRA治疗后，与DN组相比BG、BW没有明显变化，KW/BW明显下降(P<0.05)，KW及UAIb/Ucr比值明显降低(P<0.01)。治疗组大鼠与C组比较KW无明显差异(见表1) 。 表1 各组大鼠BG、BW、KW、KW/BW、UAIb/Ucr变化

　　2.2 大鼠肾脏病理变化 光镜下DN组大鼠肾脏表现为肾小球体积增大，弥漫性的肾小球系膜区增宽，细胞外基质弥漫增多，部分可见毛细血管基底膜增厚及毛细血管腔闭塞。治疗组上述改变较轻 (见图1)。

　　2.3 免疫组织化学染色结果 光镜下可见C组棕黄色pcadherin蛋白于肾小球基底膜处呈线性分布，DN组pcadherin蛋白表达明显减少，ATRA组pcadherin蛋白表达较DN组上调，与C组相比无明显下降 (见图2) 。图1 各组大鼠肾脏组织病理结果(PAS染色，×400)

　　2.4 免疫电镜结果 电镜下肾小球足细胞裂孔膜处可见免疫金染色的pcadherin蛋白，且与C组相比，DN组pcadherin蛋白数量减少 (见图3)。

　　2.5 RTPCR结果 与C组比较，DN组pcadherin mRNA表达减少(P<0.01)，ATRA组pcadherin mRNA表达较DN组明显上调(P<0.01)，与C组无明显差异(见图4，图5)。

　　3 讨 论

　　蛋白尿是DN的主要临床表现，也是诊断DN的重要标准。蛋白尿排泄量多少在一定程度上反映肾小球滤过屏障对血浆蛋白通透能力的高低。近年来的研究证明肾小球脏层上皮细胞，即足细胞形态结构及其相关分子的改变在DN发生发展过程中起着十分重要的作用，其损伤与DN蛋白尿的产生和肾小球硬化的进展明显相关〔9～11〕。

　　足细胞是位于肾小球基底膜(GBM)外侧的一种高度分化的细胞，它从胞体伸出许多突起伸向GBM形成足突。相邻的足突之间有直径为30～40 nm的裂孔,并通过渗透性的裂孔膜相连，水和小分子溶剂可以自由通过裂孔膜，而大分子的血浆蛋白则不能通过。裂孔膜由nephrin、pcadherin、podocin等多种蛋白质组成，这些蛋白质分子相互作用对维持足细胞正常的结构和功能具有重要意义。

　　国外一些研究表明，除了跨膜蛋白nephrin，足细胞裂孔膜上的另一个跨膜蛋白pcadherin可能参与蛋白尿的生成过程。Xu等研究表明pcadherin在高糖刺激的足细胞和早期DN肾小球内的表达降低〔12〕;Liu等采用静脉注射pcadherin抗体的动物模型，证实pcadherin的损伤可导致非nephrin或NEPH1依赖的蛋白尿〔13〕。以上研究均提示pcadherin在肾小球滤过屏障中起着重要作用。

　　在本实验中，DN大鼠UAlb排泄量明显增多，免疫电镜及免疫组化结果显示，DN时pcadherin蛋白表达较正常肾组织有所减少，RTPCR结果显示DN大鼠pcadherin mRNA表达下调。上述结果均表明DN时蛋白尿的形成与pcadherin的下降有密切的关系，分析其原因可能为高糖刺激导致pcadherin表达下调〔8〕引起裂孔膜蛋白质复合体的组成发生改变，足突间的分子连接减少或中断，最终导致足突形态改变和产生蛋白尿。此外，已有研究表明pcadherin蛋白参与细胞间信号转导〔12〕，由此我们推断，肾组织内pcadherin表达下调可能使足细胞骨架蛋白的信号传递发生障碍，足细胞结构进一步破坏，并使其与GBM间相互作用减弱，导致铆钉于GBM的足细胞松动，甚至从GBM剥离、脱落，滤过膜的完整性遭到破坏导致蛋白尿产生。其具体机制有待进一步研究证实。总之，上述结果均提示pcadherin在DN蛋白尿的生成和发展过程中可能起着和nephrin同样重要的作用。因此，寻求有效手段抑制DN时pcadherin表达下调对减少DN蛋白尿有重要意义。

　　ATRA是一种天然的维生素A活性代谢产物，具有抗炎、调节免疫功能以及刺激细胞的活化和增殖等作用。既往主要作为诱导分化剂用于各类肿瘤和皮肤病的治疗。近年来研究发现，ATRA对部分肾脏病亦有治疗作用。Suzuki等的研究证实ATRA可以激活nephrin的启动子，从转录水平上使nephrin表达升高〔3〕。Vaughan〔4〕利用抗肾小球抗体诱导的肾炎小鼠模型证实ATRA可以抑制nephrin的减少，从而阻止蛋白尿的形成。在对DN的治疗方面，国内已有学者应用STZ诱导的DM大鼠证实ATRA可减少早期DN大鼠尿足细胞排泄，降低尿蛋白，对肾脏足细胞损伤具有保护作用〔14〕。

　　在本实验中，ATRA组大鼠UAlb/UCr较DN组明显降低，免疫组化及RTPCR结果显示，与模型组相比较经ATRA治疗后的DN大鼠肾组织中pcadherin蛋白及mRNA表达上调，进一步证实ATRA可通过上调pcadherin对足细胞及相关分子损伤起到保护作用，从而减少DN UAlb排泄。此外，ATRA治疗组大鼠KW及KW/BW比值较模型组降低，PAS染色光镜下可见肾小球细胞肥大及细胞外基质增多有所改善，提示ATRA对早期DN肾脏病变具有治疗作用。

　　综上所述，ATRA可逆转早期DN肾小球足细胞pcadherin蛋白的下调，对足细胞及相关分子损伤具有保护作用，从而降低早期DN大鼠UAlb排泄量，延缓DN的进展。

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