Rho/Rock信号通路在原发性高血压肾纤维化中作用

　　作者：李君,孙建平,付晓波 作者单位：青岛大学医学院,山东 青岛 266021; 青岛大学医学院附属医院肾内科; 青岛盐业职工医院内科)

　　【摘要】 目的 探讨Rho/Rock 信号通路在原发性高血压肾纤维化中的作用。方法 选择31例原发性高血压病人，依据24 h尿微量清蛋白排泄率(UAER)分为正常清蛋白尿组(A组)11例、微量清蛋白尿组(B组)10例和尿毒症组(C组)10例，选取正常体检者10例作为对照组，用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定各组血清转化生长因子β(TGFβ)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)水平，分析TGFβ、MMP9、ROCK1在各组间的表达规律及三者之间的相关性。结果 与对照组比较，A、B、C组TGFβ、MMP9、ROCK1血清浓度均显著升高(F=14.498～126.037，q=3.222～20.617;P<0.05、0.01);B、C组TGFβ及ROCK1血清浓度较A组显著升高(q=4.797～17.636，P<0.01)，B、C组间TGFβ、ROCK1血清浓度差异无显著(q=0.612、1.175，P>0.05);B组 MMP9血清浓度较A、C组显著增高(q=4.799、5.959,P<0.01)，而A、C组之间差异无显著性(q=1.299，P>0.05)。血清TGFβ与MMP9、TGFβ与ROCK1、MMP9与ROCK1浓度之间均呈正相关(r=0.381～0.652，P<0.05)。结论 Rho/Rock 信号通路可能参与了高血压肾纤维化过程。

　　【关键词】 肾脏;纤维化;高血压;Rho/Rock信号通路;转化生长因子β;基质金属蛋白酶类

　　EFFECT OF Rho/Rock SIGNALING PATHWAY ON RENAL FIBROSIS IN PRIMARY HYPERTENSION

　　LI JUN, SUN JIANPING, FU XIAOBO

　　Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China);

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of Rho/Rock signaling pathway on renal fibrosis in primary hypertension. Methods Thirtyone patients with primary hypertension were divided into normalproteinuria group (group A, 11 cases), microalbuminuria group (group B, 10) and uremic group (group C, 10) based on urinary albumin excretion rate in 24 hours. Ten healthy adults served as normal control group (group NC). Enzymelinked immunosorbent assay was performed to determine the serum concentrations of TGFβ,MMP9 and ROCK1. Expression patterns of TGFβ,MMP9 and ROCK1 and the correlation among the serum concentrations of TGFβ,MMP9 and ROCK1 were analyzed by ANOVA and SNK test. Results The serum TGFβ, MMP9 and ROCK1 in groups A, B and C were significantly increased than that of the control group (F=14.498-126.037,q=3.222-20.617;P<0.05,0.01). The serum TGFβ and ROCK1 in groups B and C were significantly increased than that of group A (q=4.797-17.636;P<0.01), but the difference of that between groups B and C was not significant (q=0.612,1.175;P>0.05). The serum MMP9 of group B was significantly increased than that of groups A and C (q=4.799,5.959;P<0.01), but the difference of that between groups A and C was not significant (q=1.299,P>0.05). There existed significant correlation between TGFβ and ROCK1, MMP9 and ROCK1, MMP9 and ROCK1 (r=0.381-0.652,P<0.05). ConclusionIt is likely that Rho/Rock signaling pathway involves in the process of renal fibrosis in primary hypertension.

　　[KEY WORDS] kidney; fibrosis; hypertension; Rho/Rock signaling pathway; transforming growth factor beta; matrix metalloproteinases

　　长期的高血压可以导致高血压肾损害，其发生机制主要包括血流动力学因素[1]和非血流动力学因素，前者包括肾血管阻力增加，肾小动脉痉挛，持续高血压引起肾前小动脉硬化，导致肾脏缺血;后者包括肾素血管紧张素醛固酮(RAAS)的激活，导致血管内皮受损,诱导肾脏系膜细胞及肾小管上皮细胞等产生转化生长因子β(TGFβ)，通过受体信号转导，促进细胞外基质(ECM)形成和沉积，抑制ECM降解，导致肾纤维化。其中，TGFβ被认为是最重要的促纤维化因子[2]。研究认为，循环中的TGFβ在肾纤维化过程中也起重要作用，如果能明确参与TGFβ促纤维化作用的信号通路，则有可能对其进行干预，进而延缓或阻断肾纤维化的进展。近期NAGATOYA 等[3]研究显示，Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)选择性阻断剂Y27632能够改善小鼠肾间质纤维化(RIF)的程度。孙骅等[4]通过动物实验也推测，Rho/Rock 信号通路在RIF的发生机制中起重要作用。这些研究使Rho/Rock 信号通路受到关注，但关于ROCK在高血压肾损害病人的表达及作用少有报道。本实验观察在原发性高血压病人血清中的表达，旨在初步探讨Rho/Rock 信号通路在高血压RIF中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　2009年3-5月，选取青岛大学医学院附属医院门诊及住院的原发性高血压病人31例，均符合1999年WHO/ISH高血压治疗指南的诊断标准。排除原发性肾脏疾病、糖尿病、脑卒中、心力衰竭、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、急性冠状动脉综合征等可引起除肾脏外其他脏器纤维化的疾病，并除外高脂血症及高尿酸血症。检测24 h尿微量清蛋白排泄率(UAER)，并以此分组。正常清蛋白尿组(A组)11例，UAER每24 h为0～30 mg;微量清蛋白尿组(B组)10例，UAER每24 h为30～300 mg;尿毒症组(C组)10例，每24 h为UAER >300 mg。同时，选取我院查体中心健康查体者10例作为正常对照组。各组间年龄、性别组成、体质量指数(BMI)差异无统计学意义。见表1。表1 各组一般资料比较　(略)

　　1.2 检测指标及方法

　　各组均取晨空腹静脉血5 mL(血液透析者抽取透析当日晨血),放置30 min血液凝固后，1 500 r/min离心10 min，留取2 mL血清，置-70 ℃冰箱冻存,剩余血清送检验科常规检测肝肾功能等生化指标。血清TGFβ、MMP9、ROCK1检测采用固相夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法，试剂盒由上海锐聪生物工程有限公司提供。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS 11.0统计学软件进行数据处理，计量资料结果用±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验;相关性分析采用直线回归及相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组间各检测指标比较

　　与对照组相比较，A、B、C组病人TGFβ、MMP9、ROCK1的血清浓度均有显著性升高(F=14.498～126.037，q=3.222～20.617,P<0.05、0.01);B、C组TGFβ及ROCK1血清浓度较A组显著升高(q=4.797～17.636,P<0.01)，B、C组间TGFβ及ROCK1血清浓度差异无显著意义(q=0.612、1.175，P>0.05);B组 MMP9血清浓度较A、C组显著增高(q=4.799、5.959，P<0.01)，而A、C组之间差异无显著性(q=1.299，P>0.05)。见表2。表2 各组血清TGFβ、MMP9和ROCK1浓度检测结果比较(略)

　　2.3 血清TGFβ、MMP9、ROCK1之间的相关性

　　血清TGFβ与MMP9浓度呈显著正相关(r=0.480，P<0.05)，TGFβ与ROCK1浓度呈显著正相关性(r=0.652，P<0.01)，MMP9与ROCK1浓度呈显著正相关(r=0.381，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　长期高血压引起肾脏损害的机制主要包括高血压引起的血流动力学因素改变及非血流动力学因素改变，前者包括高血压引起肾血管阻力增加，肾小动脉痉挛，持续高血压引起肾前小动脉硬化，入球小动脉玻璃样变，小叶间动脉及弓状动脉内膜增厚，血管腔狭窄，导致肾脏缺血[5];后者因素包括RAAS激活，内皮素1及血栓素A2等缩血管物质生成增加，诱导肾脏系膜细胞及肾小管上皮细胞等产生TGFβ，通过受体信号转导，促进ECM形成和沉积，抑制ECM降解，导致肾纤维化。在动物实验中，抑制RAAS的药物可以减轻RIF[6]。有研究结果显示，肾脏纤维化在肾功能恶化的过程中起到更重要的作用，TGFβ被认为是最重要的促纤维化因子[2]，通过与多种细胞因子的相互作用及多条信号转导通路参与肾纤维化。其中，本实验主要研究的是Rho/Rock 信号通路。

　　Rho蛋白是最早发现的Ras相关单体GTP酶，ROCK是目前功能研究最为清楚的Rho下游靶效应分子。ROCK接受Rho传递的活化信号后对其底物肌球蛋白磷酸酶进行磷酸化修饰，最终引起细胞肌动蛋白聚合增加、张力纤维形成与局部黏附激酶活化，从而影响细胞趋化、黏附和收缩等生物学行为。在肾脏中主要以ROCK1形式存在。

　　NAGATOYA等[3]研究结果显示，ROCK1的特异性阻断剂Y27632能够改善单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠RIF的程度，提示该激酶可能在RIF中扮演重要角色。孙骅等[4]的动物实验研究显示，ROCK1基因在RIF发生早期即有明显上调， 在病变进展阶段与RIF指标呈显著的正相关;而至纤维化后期下降至基础表达水平，进一步证实ROCK1参与了RIF的形成。有学者通过动物实验研究也发现，在体外培养的肾小管上皮细胞加入ROCK的特异性阻断剂阻断Rho/Rock信号通路后，肾小管上皮细胞转分化被抑制，提示Rho/Rock 信号通路在TGFβ诱导的肾小管上皮转分化即RIF中起重要作用。

　　在本实验中，我们观察到A组血清TGFβ及ROCK1浓度较正常对照组显著升高，差异有统计学意义。TGFβ被认为是最重要的促纤维化因子，它的升高提示在高血压初期，病人体内可能已经有纤维化病理过程的启动，B组TGFβ血清浓度较A组又有显著性升高，在排除了心肌梗死、肝纤维化及肺纤维化等可能存在的纤维化情况后，提示随着病人UAER的增加及肾功能的下降，病人肾脏纤维化的程度在逐渐加重。而ROCK1血清浓度A组较对照组明显升高，且与TGFβ的浓度变化趋势一致，相关性有统计学意义，由此推测，ROCK1可能参与了原发性高血压肾纤维化的病理过程，并可能与 TGFβ的促纤维化作用之间存在联系。

　　本实验同时检测了原发性高血压各组与对照组血清MMP9水平。MMP9是降解TBM蛋白质的主要酶之一[7]。在正常生理条件下, 肾脏固有细胞和单核细胞可以表达微量MMP9，对维持肾脏的正常代谢和降解重塑具有重要意义[8]。在病理情况下，可被炎症因子等激活，降解ECM,损伤肾脏基底膜，基底膜损伤加重炎症反应，形成恶性循环，导致肾脏损伤修复过程紊乱，引起纤维化。近年多项实验及临床研究均提示MMPs及TIMPs参与了肾纤维化过程，但其具体机制仍不明确，且关于MMPs及TIMPs(尤其是MMPs)在肾纤维化过程中活性与表达是增高还是降低，仍存在争议。目前，对于这些蛋白水解酶的表达及活性改变在肾脏纤维化病理过程中作用尚不清楚。有实验研究也显示，自发性高血压大鼠(SHR)MMPs活性水平的增加和纤维化的增强同时存在的矛盾现象[9]。本实验结果显示，MMP9在A组即有显著升高，B组血清含量增加更明显，据此，我们推测在原发性高血压肾脏损伤早期存在着MMP9活性增高，引起肾脏损伤修复过程紊乱;而C组血清含量下降至与A组无显著差异的水平，考虑与尿毒症终末期肾脏已呈“固缩肾”改变，炎症反应趋于“静止”有关。

　　对培养的人类系膜细胞研究显示，TGFβ可以增加MMP2 mRNA的表达，而使MMP1 mRNA的表达降低[10]，提示在TGFβ与MMPs之间存在密切联系。本文结果显示，各组高血压病人TGFβ与MMP9血清水平存在相关性，进一步证实了这种联系的可能。但TGFβ是否可以增加MMP9的活性，从而加重纤维化，尚需进一步实验证实。

　　总之，对原发性高血压肾损害不同阶段的病人研究表明,早期清蛋白尿正常组病人血清TGFβ及ROCK1浓度显著升高，在微量清蛋白尿组升高更明显，且二者变化趋势一致，提示TGFβ可能通过Rho/Rock 信号通路参与了高血压肾纤维化过程。

　　【参考文献】

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