IgA肾病肾组织AT1、AT2表达与肾小管上皮表型转化及肾间质血管病变发生学的关系

　　作者：蒋娜，于琳华，任淑婷，李恒力，郭尚温，韩水平 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第一附属医院病理科;2. 病理系，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨肾内肾素血管紧张素系统(RAS)与IgA肾病的肾小管上皮细胞表型转化及肾间质、肾血管病变的关系。方法 应用免疫荧光、常规病理学、透射电镜等技术，观察15例Ⅱ级、15例Ⅲ级和20例Ⅳ-Ⅴ级共50例IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)肾活检组织的病理形态学特点，应用免疫组织化学Envision法检测肾组织内AT1、AT2、αSMA和TGFβ的表达。结果 50例IgAN中28例有肾小管间质损害(占56%);肾小管上皮细胞、肾间质细胞和肾小球系膜细胞均有不同程度的AT1、AT2和TGFβ表达，αSMA除在小球外细小动脉壁表达外，在肾小管上皮细胞、肾间质细胞和肾小球系膜细胞也都有表达。IgAN肾组织AT1(r=0.9977, P=0)、AT2(r=0.8367, P<0.05)和TGFβ(r=0.9901, P=0)的表达强度与肾间质血管病变程度呈正相关。结论 肾小管上皮细胞AT1及AT2的表达与IgAN的肾小管和小球外小动脉病变程度有密切的相关性;AngⅡ参与了肾间质和球外血管病变的形成。

　　【关键词】 IgA肾病;表型转化;AT1;AT2;TGFβ;αSMA

　　Study on the relationship of expression of AT1, AT2 in IgAN renal tissuewith pathogenesis of proximal tubular cell transdifferentiationand renal interstitial vascular pathological changes

　　Jiang Na, Yu Linhua, Ren Shuting, Li Hengli, Guo Shangwen, Han Shuiping

　　1. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University;

　　2. Department of Pathology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the association of nephrogenous reninangiotensin system (RAS) with pathogenesis of proximal tubular cell transdifferentiation and renal interstitial vascular pathological changes. Methods We observed the morphological changes of renal biopsy tissues by light microscopy and fluorescence microscopy. Expressions of AT1, AT2, TGFβ and αSMA were detected by immunohistochemistry in 50 cases of IgAN. Results Among them, 28 cases (56%) showed renal interstitial fibrosis. Immunohistochemistry showed that AT1 and AT2 were expressed in the glomeruli, renal tubule, renal interstitium and vas. There were expressions of αSMA in the thick wall of capillary, renal tubular cell, renal interstitium and mesangium. Conclusion The expession of AT1 and AT2 in renal tubular cells has close relationship with the pathological changes of renal tubule and vas outside glomeruli. AngII may have a positive correlation with the vascular and renal interstitial pathological changes outside glomeruli.

　　KEY WORDS: IgA nephropathy; phenotype transdifferentiation; AT1; AT2; TGFβ; αSMA

　　IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是以免疫球蛋白IgA在肾小球沉积为主要病理特征的一种最常见的全球性肾小球疾病，是导致肾功能衰竭的主要疾病之一[1]，是临床肾脏病学和基础病理学研究的热点疾病。1968年自Berger首次报道本病至今，虽然进行了广泛的研究，但其发病机制仍然不清楚，而且发病呈逐年上升趋势。临床和大量肾活检病理观察发现：原发性肾小球疾病的肾小球病变和肾小管间质病变程度不完全平衡;肾小管、肾间质和小球外血管病变对肾功能的损害程度，明显大于肾小球本身病变对肾功能的损害;伴有明显肾小球外血管病变的IgAN，其病情进展快，肾外症状明显和预后差，球外血管病变是影响肾脏疾病治疗时机和预后的重要单因素病变。这对以往公认的小球病变决定小管病变发生的观点提出了质疑，并提示二者可能各自有其独特的发病机制。然而目前对IgAN的肾小管、肾间质和球外血管病变的发生学尚无定论。近年来，国外对IgAN特别是对初期出现高血压症状的IgAN，应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂治疗取得显著疗效，这表明器官或局部组织内的肾素血管紧张素系统(reninangiotensin system, RAS)中的主要效应分子AngⅡ，在相关病变形成中起着重要的调节作用，但尚未见有关方面的病理研究报道。本实验旨在探讨肾内RAS与IgA肾病的肾小管上皮细胞表型转化及肾间质、肾血管病变的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　具有完整临床资料的50例住院患者的肾活检标本。

　　1.2 试剂

　　兔抗人、大鼠AT1、AT2、TGFβ单克隆抗体、鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体均为北京中杉金桥生物科技有限公司产品;Envision免疫组化试剂盒为福州迈新生物工程有限公司产品。

　　1.3 仪器

　　Olympus光学显微镜，Motic图像分析系统。

　　1.4 方法

　　全部肾穿刺组织经直接免疫荧光检查，确诊为IgA肾病。系列光学显微镜检查每例肾组织的病变程度，按Lee等[2]改良的Meadow组织学分类方法对病变程度进行分级，其中Ⅱ级20例，Ⅲ级15例，Ⅳ-Ⅴ级15例。对不同级别的IgAN的小动脉病变进行半定量观察、记录，参照对IgAN病变损害程度半定量分级标准[3]：球外血管病变：Ⅰ级，内皮细胞肿胀，记为1分;Ⅱ级，内皮细胞肿胀，平滑肌细胞增生，记为2分;Ⅲ级，内皮细胞肿胀，平滑肌细胞增生，血管壁玻璃样变性，记为3分。对其中部分病例进行超微结构检查。

　　应用免疫组织化学Envision方法，取组织切片，常规脱蜡水化。浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液中入微波炉中修复抗原，正常小牛血清封闭。分别滴加一抗兔抗人、大鼠AT1、AT2、TGFβ单克隆抗体和鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，置湿盒中4℃冰箱过夜。次日晨取出，滴加Envision试剂(二抗分别为辣根过氧化酶标记的抗鼠或抗兔抗体)，滴加DAB显色液，苏木素复染。每批实验均设阴性对照(PBS液替换一抗)。检测所有肾组织的AT1、AT2、αSMA和TGFβ表达，采用Motic数码医学图像分析系统(西安交通大学医学院形态中心提供，灰度值与表达强度成正比)对AT1、AT2和TGFβ免疫组织化学切片肾小管染色情况进行图像分析。并对表达结果进行统计学处理，重点分析与肾小管上皮细胞损伤的关系。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS10.0 for windows统计软件，采用单因素方差分析、χ2检验和Pearson相关分析的统计方法进行处理，以P<0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 50例IgAN肾活检组织的病变特点

　　28例伴有肾小管间质损害(占56%)，表现为上皮细胞不同程度变性、坏死，亚致死性脱落和萎缩。在萎缩的肾小管中，可见部分上皮细胞有不同程度的极向改变和细胞肥大，偶见有上皮细胞穿越和溶解基底膜的现象(图1A)。肾间质有不同程度的淋巴细胞和其他单个核炎细胞浸润(图1B)、纤维组织增生。小动脉壁平滑肌细胞有不同程度的肥大，血管壁玻璃样变性和血管内皮细胞增生、肿胀(图1C)。不同级别的IgAN肾组织的血管病变程度之半定量评分，结果见表1。

　　2.2 50例IgAN肾活检组织内AT1、AT2和TGFβ表达的检测结果

　　肾小球、肾小管、肾间质和球外血管的细胞浆和细胞膜内有不同程度表达，呈棕黄色颗粒(图2、图3)。统计学分析发现AT1、AT2和TGFβ的表达强度与IgAN的组织损伤程度呈正相关(表1)。表1 不同病变级别的IgAN肾小管上皮AT1、AT2和TGFβ表达与球外血管病变程度的相关性分析(略)

　　2.3 50例IgAN肾活检组织内αSMA表达的检测结果

　　αSMA除在血管壁表达外，在肾小管上皮细胞(图4)、肾间质细胞和肾小球的系膜细胞都有表达。不同级别的IgAN肾小管上皮细胞αSMA表达有显著性差异(表2)。统计学分析发现肾小管上皮细胞的αSMA表达与AT1的表达有正相关关系(r=0.9345，P<0.05);AT2与αSMA的相关系数(r=0.9601，P<0.05)有正相关关系。提示AT1、AT2表达与肾小管上皮细胞转型分化呈正相关。表2 不同级别的IgAN肾小管上皮细胞αSMA表达结果(略)

　　3 讨 论

　　IgAN是全球最常见的肾小球疾病，约占原发性肾小球疾病的30%-40%。最早认为：IgAN主要是以IgA在肾小球系膜区沉积为特征，可伴有其他免疫球蛋白及补体的微弱沉积;由于激活多种细胞因子及促发免疫反应，而形成以肾小球系膜增生为主的病变;仅有极少病例因肾小球硬化而致肾功能衰竭[3]。然而1990年有文献报道[4]了239例IgAN患者，发现部分IgAN的肾小球病变与肾间质病变有不平衡现象，即肾小球疾病较重、但间质无明显改变的病例预后良好，而间质损害严重、肾小球无明显病变的病例预后不佳。因而推测肾间质病变是预测IgAN的重要指标。本实验观察了50例IgAN的组织学病变，发现均伴有肾间质血管病变。一直沿用的WHO对IgAN的诊断分级标准中，对球外血管病变重视不够。至今对IgAN的小管、间质和球外血管病变的发生学尚无定论。有研究认为肾小管上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)是肾间质纤维化的重要发病机制之一[5]。1995年有研究[6]观察到接触肾毒素后肾小管上皮细胞转化以来，肾小管上皮细胞通过表型改变转变成肌纤维母细胞的事实已经被越来越多的实验证实。本实验应用免疫组织化学技术发现IgAN的病变肾小管上皮细胞有αSMA阳性表达，HE染色切片中可见肾小管上皮细胞的极向发生改变，特别在萎缩的肾小管中可见基底膜发生溶解破坏、上皮细胞由肾小管向间质迁移的现象。我们还发现，随着IgAN病变程度的加重，肾小管上皮细胞表达αSMA阳性的细胞个数也是逐渐增多。除了小管上皮细胞有阳性表达外，小管间质细胞也呈阳性表达，且表达强度也随病变程度加重而增强。由此可见，肾小管上皮细胞损伤后的一个重要反应就是发生转型分化，这可能是肾小管上皮主动参与肾间质损伤的重要形态学变化。

　　越来越多的证据表明，肾脏局部RAS的激活在肾脏疾病进展过程中起着十分关键的作用[78]。肾组织局部以自分泌和旁分泌的方式产生RAS的重要成分，调节和主动参与炎症反应。AngⅡ可使成纤维细胞活化并转变为肌成纤维细胞，这些被激活的成纤维细胞发生增殖，并侵入到肾小球和肾小管周围，导致基质成分在肾间质积聚。我们主要研究了血管紧张素Ⅱ对肾小管上皮细胞转分化的作用。从实验结果可以看出，随着IgAN病变程度的增加，肾小管上皮细胞表达AT1、AT2和TGFβ的平均灰度也增强。AngⅡ诱导肾小管上皮细胞发生表型转化的可能机制主要是通过刺激和上调多种肾组织细胞的TGFβ表达。另外，AngⅡ是一种重要的血管活性物质和促生长因子。我们在研究中，还探讨了AngⅡ与球外血管病变之间的关系。结果表明，AngⅡ对IgAN的血管病变的形成可能有促进作用,其机制尚需进一步探讨。

　　【参考文献】

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　　[7]Yang J, Liu Y. Dissection of key events in tubular epithelial to myofibroblast transition and its implication in renal interstitial fibrosis in mice [J]. J Am Pathol, 2001, 159(4):14651475.

　　[8]于琳华，任淑婷，国荣，等. 陕西地区IgAN的病理和流行病学特点 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2005, 26(5):450453.