苦参山楂合剂对单侧输尿管梗阻大鼠结缔组织生长因子表达的影响

　　作者：姚钢炼　廖婷婷　宁宁　高登峰　桂保松 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院肾病科，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 探讨中药复方苦参山楂合剂对肾间质纤维化大鼠结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响以及其对肾间质纤维化的防治作用。方法 40只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、苯那普利组、苦参山楂合剂小剂量组和大剂量组。以单侧输尿管结扎术建立肾间质纤维化的动物模型。术后第14天取术侧肾组织做HE、Masson染色及CTGF、α平滑肌动蛋白(αSMA)和Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)免疫组化检测，并运用图像分析系统作半定量分析。结果 苦参山楂合剂可以显著改善梗阻侧肾组织病理变化，下调CTGF表达，减少αSMA及ColⅢ沉积。结论 苦参山楂合剂可能通过下调CTGF并抑制肌成纤维细胞的活化来起到防治梗阻性大鼠肾间质纤维化的作用。

　　【关键词】 苦参山楂合剂;纤维化;肾间质;结缔组织生长因子;肌成纤维细胞

　　Effect of matrine and crataegus mixture on connective tissue　growth factor in unilateral ureteral obstruction rats

　　Yao Ganglian, Liao Tingting, Ning Ning, Gao Dengfeng, Gui Baosong

　　(Department of Nephrology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of matrine and crataegus mixture on the renal interstitial fibrosis in unilateral ureteral obstruction (UUO) rats. Methods Forty male SpragueDawley rats were randomly divided into 5 groups on average: sham group (A), model group (B), benapril group (C), smalldose matrine and crataegus mixture group (D), and largedose matrine and crataegus mixture group (D). The models were established by UUO of the left side. On the 14th day after operation, the obstructed kidney was taken out. Then HE, Masson, and immunohistochemical staining of connective tissue growth factor (CTGF), αsmooth muscle actin (αSMA) and collagen Ⅲ (Col Ⅲ) were conducted. After that, semiquantitative analysis was performed. Results Matrine and crataegus mixture treatment can lessen the pathological lesion and reduce the levels of CTGF, αSMA and Col Ⅲ. Conclusion Matrine and crataegus mixture may downregulate expressions of cytokines such as CTGF, and inhibit the activation of cell producing ECM and then the sendimentation of ECM, thus preventing renal interstitial fibrosis.

　　KEY WORDS: matrine and crataegus mixture; renal interstitial fibrosis; connective tissue growth factor; myofibroblast

　　肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis)几乎是所有慢性肾脏疾病发展的最终结果，与慢性肾功能衰竭进展密切相关，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一[1]，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成、降解失衡和大量积聚是引起肾间质纤维化的主要原因。寻找针对肾间质纤维化发生机制的药物,将是防治肾间质纤维化、延缓尿毒症发生的有效措施。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)是公认的致纤维化的重要因子，但其同时具有抗炎、抗增殖等作用，如长期阻断TGFβ1来防治肾脏纤维化，就有可能引起重度炎症甚至死亡等不良反应的发生[2]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是TGFβ1的下游效应介质,在肾脏表达最多，只介导致纤维化效应[3]。因此，调控肾脏局部CTGF的表达，对延缓慢性肾脏疾病纤维化的进展，可能有非常重要的意义。在本研究中我们运用大鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction, UUO)建立肾间质纤维化模型，用苦参山楂合剂灌胃，通过观察肾间质病理变化及测定CTGF、α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin, αSMA)及Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ, Col Ⅲ)的合成表达情况，探讨该药物对大鼠肾间质纤维化的影响，以阐明其保护作用的部分机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠40只，清洁级，体重180-200g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机分为5组：假手术组(A组)：蒸馏水10mL/(kg·d);模型组(B组)：蒸馏水10mL/(kg·d);苯那普利组[4](C组)：苯那普利10mg/(kg·d);苦参山楂合剂小剂量组(D组)：苦参山楂合剂50mg/(kg·d);苦参山楂合剂大剂量组(E组)：苦参山楂合剂100mg/(kg·d)。每组8只，均于术前1d开始灌胃给药。

　　1.2 造模方法 UUO致肾小管间质纤维化模型参照文献[3]。A组打开腹腔后分离左侧输尿管，并不结扎即关闭腹腔。术后第14天处死各组大鼠,取梗阻侧肾脏，用10%(体积分数)中性甲醛溶液固定。

　　1.3 实验用药 苦参山楂合剂(主要由苦参、生山楂、白附片等中药组成)，水煎，大、小剂量分别浓缩成每毫升相当于生药1.7g、0.85g(自制)，置4℃冰箱保存备用。盐酸苯那普利由北京诺华有限公司提供(批号：00058)。

　　1.4 免疫组化染色 采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶法(SP法)。2μm厚的石蜡切片常规脱蜡水化，用含3%(体积分数)H2O2的甲醇封闭内源性过氧化物酶(抗原修复采用煮沸法)。正常山羊血清封闭液室温封闭20min后，分别加小鼠抗人SMA单克隆抗体(1∶50，北京中山公司，适用于人、大鼠、兔)，兔抗大鼠CTGF多克隆抗体(1∶50，武汉博士德生物工程公司)，小鼠抗人Col Ⅲ单克隆抗体(1∶50，北京中山公司，适用于人、大鼠、兔)，4℃冰箱过夜。再加生物素标记的山羊抗兔Ⅱ抗(CTGF，北京中山公司)或山羊抗小鼠Ⅱ抗(αSMA，ColⅢ，北京中山公司)，7℃孵育30min，链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶7℃ 30min，DBA显色3min，蒸馏水冲洗终止显色。苏木素复染核2min，自来水冲洗，常规脱水、透明、封片。同时用正常血清作阴性对照。

　　1.5 肾间质病理评分 HE、Masson染色后，在低倍镜下(×100)依序单盲(观察者不知标本来源的差异性)观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾间质视野，分别计算肾脏组织间质损伤指数、纤维化指数、细胞浸润程度评分[4]，然后分别计算各个评分的均值，作为该标本的肾间质损伤指数。

　　1.6 图像分析 采用Qwin550CW型图像信号采集与分析系统(Leica，德国)，分别对各组免疫组化染色的肾脏标本切片进行灰度值测量。每组测量来自不同个体的8张组织切片，高倍镜下(×400)每张切片分别取2个视野，每个视野面积约为0.1mm2。测量时每个视野随机测量4个随机面积内阳性显色的平均灰度值，每组共测量64(8×2×4)个数据。灰度值越高表明相应蛋白表达越低，反之则表明相应蛋白表达越高。

　　1.7 统计学处理 数据均采用(±s)表示，用SPSS12.0统计软件进行统计分析。组间差异比较用单因素方差分析，两两比较用SNKq检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肾组织病理改变 HE及Masson染色显示，B组间质有大量炎性细胞浸润和纤维组织增生，部分肾小管萎缩、管腔闭塞或扩张、坏死，小管间质区面积扩大，小管基底膜不同程度断裂增厚;C、D、E组间质可见少量的炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，肾小管轻度扩张。

　　2.2 肾间质损伤指数评分 B、C、D、E组肾间质损伤指数显著高于A组(P<0.01);C、D、E组的肾间质损伤指数显著低于B组(P<0.01)，而C、D、E组之间无显著性差异(P>0.05，表1)。

　　表1 各组肾间质损伤指数、纤维化指数和细胞浸润程度评分(略)

　　Table 1 Renal interstitial lesion index, fibrosis index, and cellular infiltration level in each group

　　*P<0.01 vs. group A; ▲P<0.01 vs. group B

　　2.3 肾组织内αSMA表达 镜下可见，A组αSMA只在正常肾组织血管壁上表达，小球和小管中无阳性染色;B、C、D、E组除血管壁上有表达外，可见大量阳性细胞出现在肾间质细胞胞浆中，同时部分小管上皮细胞胞浆内也出现阳性棕黄色染色颗粒，其中以B组更为明显。各组大鼠肾小球内均无明显αSMA阳性染色。免疫组化半定量结果统计分析示B、C、D、E组肾脏αSMA蛋白表达显著高于A组(P<0.01)，C、D、E组显著低于B组(P<0.01)，E组虽低于D组(P>0.05)，但C、D、E组之间无显著性差异(P>0.05，表2)。

　　2.4 肾组织内CTGF表达 镜下可见，A组脏层与壁层上皮细胞、间质细胞、小管旁毛细血管内皮细胞、间质成纤维细胞中都可有微量棕黄色颗粒表达，肾间质区无或仅有微量表达;B、C、D、E组表达增多，主要分布在间质内、肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞以及肾小球壁层上皮细胞，其中以B组更为明显。免疫组化半定量结果统计分析示，B、C、D、E组肾脏CTGF蛋白表达显著高于A组(P<0.01)，C、D、E组显著低于B组(P<0.01)，E组虽低于D组(P>0.05)，但C、D、E 组之间无显著性差异(P>0.05，表2)。

　　2.5 肾组织Col Ⅲ表达 镜下可见，A组肾脏Col Ⅲ表达极少，在肾间质基质中呈散在黄色细线样分布;B、C、D、E组表达增多，呈局部或弥漫棕黄色条索状分布，其中以B组更为明显。免疫组化半定量结果统计分析示，B、C、D、E组肾脏Col Ⅲ蛋白表达显著多于A组(P<0.01)，C、D、E组显著少于B组(P<0.01)，E组虽低于D组(P>0.05)，但C、D组与E组之间无显著性差异(P>0.05，表2)。

　　表2 各组肾脏组织αSMA、CTGF、Col Ⅲ灰度值(略)

　　Table 2 Gray scale of αSMA, CTGF, and Col Ⅲ in renal tissues by immunohistochemistry

　　*P<0.01 vs. group A; ▲P<0.01 vs. group B

　　3 讨论

　　肾间质纤维化的发病机制尚未完全阐明。已有的研究表明，致纤维化生长因子或细胞因子表达增加、细胞表型转化可能起重要作用。CTGF是近年新发现的一种细胞因子，作为介导TGFβ1促纤维化作用的下游蛋白因子，其可特异地对间充质来源细胞，如成纤维细胞具有促细胞增生和细胞外基质合成等生物学效应，其分泌失调可能与多种肾脏疾病的发生和进展有极为密切的关系。CTGF在肾小球和肾间质的高表达是导致慢性肾脏疾病纤维化进展的重要原因。调控肾脏局部CTGF的表达，对延缓慢性肾脏疾病纤维化的进展，可能有一定意义。CTGF成为了近来治疗肾间质纤维化的一个新的靶点[56]。

　　苦参山楂合剂由苦参、生山楂、附片等中药组成。苦参有清热燥湿之功效，生山楂味酸、性甘、微温，有化滞消积、活血化淤滞功效[7]，附片可温肾、回阳救逆。我们多年临床应用该合剂治疗慢性肾衰竭患者收到良好效果。本研究发现经苦参山楂合剂干预后，梗阻侧肾脏CTGF蛋白表达较模型组明显降低，表明苦参山楂合剂可以在一定程度上减少CTGF蛋白的表达，也提示其可能通过这一途径抑制ColⅢ的表达，减少肾间质纤维化的程度。

　　正常时ECM产生细胞处于静息状态，其代谢和功能不活跃，但在病理情况下，ECM产生细胞不仅形态发生改变，而且表现出明显增殖、分泌细胞因子、合成大量ECM和产生蛋白降解酶等功能变化，这一系列变化被称为活化[8]。肌成纤维细胞(myofibroblast, MyoF)是一组平滑肌细胞样的细胞，胞浆内出现αSMA是其活跃的标志性抗原[9]。MyoF通过分泌细胞因子如TGFβ1和CTGF、趋化因子、生长因子、ECM和蛋白酶而发挥生物学作用[10]。目前，αSMA被公认是较好的反应肾间质纤维化程度的形态测量学指标，αSMA表达的多少与肾间质纤维化的程度以及肾脏疾病的进展呈正相关[11]。经苦参山楂合剂干预后，UUO大鼠梗阻侧肾组织内αSMA阳性表达程度较模型组明显减少，提示苦参山楂合剂可以抑制细胞的转分化作用，进而减少ECM沉积。

　　综上所述，苦参山楂合剂可降低UUO大鼠肾脏CTGF和αSMA的表达,减轻输尿管梗阻所致的间质损伤，并同时减少了ColⅢ的沉积, 且大剂量的效果更为良好，提示本复方可能通过抑制CTGF的促纤维化作用的途径并减少MyoF的活化，从而延缓了肾间质纤维化的发生。

　　【参考文献】

　　[1]Bohle A, Muller GA, Wehrmann M, et al. Pathogenesis of chronic renal failure in the primary glomerulopathies, renal vasculopathies, and chronic interstitial nephritides [J]. Kidney Int, 1996, 49(Suppl):S2S9.

　　[2]Wright EJ, McCaffrey TA, Robertson AP, et al. Chronic unilateral ureteral obstruction is associated with interstitial fibrosis and tubular expression of transforming growth factorbeta [J]. Lab Invest, 1996, 74(2):528537.

　　[3]Duncan MR, Frazier KS, Abramson S. Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor betainduced collagen synthesis: downregulation by camp [J]. FASEB J, 1999, 13(13):177486.

　　[4]赵雅妮，李惊子，王海燕. 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂与血管紧张素转换酶抑制剂抗大鼠肾脏纤维化的作用及机制探讨 [J]. 中华老年多器官疾病杂志, 2002, 1(1):3640.

　　[5]Yokoi H, M ukoyama M, Nagae T, et al. Reduction in connective tissue growth factor by antisense treatment ameliotates renal tubulointerstitial fibrosis [J]. J AM Soc Nephrol, 2004, 15(6):14301440.

　　[6]罗晓青，邓安国，朱忠华，等. 罗格列酮对糖尿病肾病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2005, 40(3):491493.

　　[7]李贵海，孙敬勇,张希林,等. 山楂降血脂有效成分的实验研究 [J]. 中草药, 2002, 33(1):5052.

　　[8]楚非，邹万忠，孙锁柱，等. 大鼠肾小管间质纤维化中肾小管上皮细胞表型转化的研究 [J]. 中华肾脏病杂志, 2003, 19(1):1014.

　　[9]贾皑，苌新明，张盈涛，等. 螺内酯对实验大鼠肝组织TGFβ1、PDGF、-及αSMA表达的影响 [J].西安交通大学学报(医学版), 2004, 25(1):7275.

　　[10]Powell DW, Mifflin RC, Valentich JD, et al. Myofibroblasts.Ⅱ intestinal subepithelial myofibroblasts [J]. Am J Physiol, 1999, 277(2 Pt 1):183201.

　　[11]De Heer E, Sijpkens Yw, Verkade M, et al. Morphometry of interstitial fibrosis [J]. Nephrol Dial Transplant, 2000, 15(Suppl 6):7273.