1型糖尿病大鼠肾脏Ⅳ型胶原的表达及坎地沙坦的干预作用

　　作者：李文丛 马博清 高琳辉 郝欣欣 王志华1 作者单位：1 河北省老年医学重点实验室(河北省人民医院内分泌科，河北 石家庄 050000)

　　【摘要】 目的 探讨1型糖尿病大鼠造模后肾脏Ⅳ型胶原的表达及肾小球病理形态改变及坎地沙坦的保护作用和机制。方法 雄性Wistar大鼠36只,随机分出正常对照组(NC组)12只，余24只腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，再随机分为糖尿病组(DM组)12只和坎地沙坦干预组(DMC组)12只;DMC组给予坎地沙坦5 mg·kg-1·d-1灌胃。干预12 w后，检测各组大鼠的空腹血糖(FPG)、血压、24 h尿白蛋白排泄量(24 h UAE)、肌酐清除率(Ccr)、肾重指数(KI);光镜下观察肾小球病理形态改变，测定肾小球平均截面积(MGA)、肾小球平均体积(MGV)和肾小球系膜基质分数(MMF);免疫组化法检测肾小球Ⅳ型胶原的表达。结果 与NC组相比，DM组大鼠的FPG、24 h UAE、Ccr及KI均显著升高(P<0.01)，MGA、MGV及MMF显著增大(P<0.01)，肾小球Ⅳ型胶原的表达明显增加(P<0.01);DMC组较DM组肾小球Ⅳ型胶原的表达明显减少(P<0.01)，FPG、24 h UAE、Ccr及KI均显著降低(P<0.01)，MGA、MGV及MMF显著减小(P<0.01);三组间大鼠血压差异无统计学意义(P>0.05)。结论 糖尿病大鼠肾脏Ⅳ型胶原表达增加;坎地沙坦具有独立于降压以外的肾脏保护作用。

　　【关键词】 糖尿病肾病,大鼠,Ⅳ型胶原,坎地沙坦

　　在我国，糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾病的第三大病因，仅次于肾炎和高血压。Ⅳ型胶原是肾小球系膜和基底膜的主要组分之一，是DN时细胞外基质增殖的主要成分，是DN早期表现之一。在DN中阻断RAS系统可以有效减轻尿白蛋白程度，延缓肾动脉硬化及肾脏纤维化的进展。坎地沙坦作为较强的血管紧张素1型受体(AT1)阻滞剂，对于其能否改善糖尿病大鼠肾脏结构及功能损伤报道不多。本研究观察坎地沙坦对糖尿病大鼠肾脏功能、肾小球病理形态改变及Ⅳ型胶原的影响，为DN的防治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型建立和分组

　　清洁级雄性Wistar大鼠36只，体重(200±20)g，购自河北医科大学实验动物中心。随机选取12只为正常对照组(NC组)，余24只一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg，72 h后尾静脉取血测随机血糖>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。造模成功的大鼠随机平分为糖尿病组(DM组，n=12)和坎地沙坦干预组(DMC组，n=12)。干预组大鼠给予5 mg·kg-1·d-1坎地沙坦(维尔亚，重庆圣华曦药业有限公司)灌胃，另两组给予等量生理盐水灌胃。实验期间自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本收集

　　干预12 w末测定全部大鼠尾动脉收缩压(SBP)，后置于代谢笼中收集24 h尿，记尿量，用于24 h尿白蛋白排泄量(24 h UAE)、尿肌酐(Ucr)测定;全部大鼠称重，用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，颈动脉取血，分离血清，测定空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr);切取左肾，去掉被膜后称重，置于4%多聚甲醛固定留作苏木素伊红(HE)、过磺酸雪夫反应(PAS)染色及免疫组化检测。

　　1.2.2 指标测定

　　FPG、Scr及Ucr用美国产BeckmanX20自动生化分析仪测定;Ccr按公式计算：Ucr×每min尿量(ml)/Scr，并以体重(kg)校正。24 h UAE采用放射免疫法检测;肾重指数(KI)=左侧肾脏重量(mg)/体重(g)。采用Panlab无创血压测量仪测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压(SBP)(取3次测量的均值)。

　　1.2.3 肾脏病理检查

　　肾组织切片4 μm，行HE和PAS染色;应用ImagePro Plus图像分析系统对PAS染色切片(400倍)进行图像分析。每张切片随机选取10个正切的肾小球，测定肾小球平均域面积(MGA)及肾小球内PAS阳性染色面积，计算肾小球系膜基质分数(MMF)即PAS阳性染色面积/MGA，及肾小球平均体积(MGV)〔1〕= β/K×(MGA)3/2。

　　1.2.4 免疫组化检测

　　采用免疫细胞组化染色法(SABC)法(SP试剂盒购于北京中山生物技术有限公司)，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照染色。石蜡包埋切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇灭活内源性过氧化物酶,胰酶修复抗原后，山羊血清封闭非特异性抗原，滴加兔抗大鼠Ⅳ型胶原抗体(1∶100，武汉博士德公司)，4℃孵育过夜。滴加二抗、三抗，最后显微镜下控制二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。肾小球Ⅳ型胶原表达采用半定量分析，即随机选取10个正切的肾小球(400倍)，根据着色情况计算阳性指数(PI)〔2〕，PI=阳性信号面积×阳性强度，求和，取平均值。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据资料以x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 基本指标

　　实验结束时，与NC组相比，DM组FPG、24 h UAE、KI、Ccr均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01);与DM组相比，DMC组除FPG外，均明显降低(P<0.05);三组间大鼠SBP差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

　　2.2 肾小球形态病理变化

　　石蜡切片经HE和PAS染色，与NC组比较，DM组大鼠MGA和MGV均显著增大(P<0.01)，肾小球内PAS阳性染色物质增多，系膜区增宽，系膜细胞增生，肾小球基底膜增厚，MMF明显增高(P<0.01);DMC组较DM组MGA、MGV及MMF均明显减小(P<0.05)。见表2。

　　2.3 肾小球Ⅳ型胶原表达

　　免疫组化结果显示，NC组大鼠肾小球仅有少量Ⅳ型胶原表达，DM组较NC组肾小球Ⅳ型胶原表达明显增强(P<0.01)，染色深且面积增大;DMC组较DM组肾小球Ⅳ型胶原表达明显减弱(P<0.05)。见表2。表1 各组大鼠FPG、24 h UAE、KI、Ccr及SBP的比较表2 各组大鼠MGA、MMF、MGV及肾小球Ⅳ型胶原表达的比较

　　3 讨 论

　　本研究通过腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，在造模后第12周，实验性糖尿病大鼠除血糖升高外，24 h UAE、肌酐清除率均明显增加;形态学的检查观察到肾小球肥大、系膜细胞及系膜基质增生、肾小球基底膜增厚，符合DN早期功能及结构改变，说明实验造模成功。

　　DN典型的病理改变是肾小球硬化，其组织学特征是肾小球基底膜增厚和细胞外基质积聚。细胞外基质主要由胶原、蛋白多糖、糖蛋白等物质组成，其中Ⅳ型胶原是肾小球系膜和基底膜的主要组分之一，是DN时细胞外基质增殖的主要成分〔3〕，故本研究选择Ⅳ型胶原来评价肾小球的病变程度;同时根据肾脏PAS染色测得肾小球系膜基质分数，其更加准确地反映了肾小球系膜基质积聚的程度。本研究结果显示，早期应用坎地沙坦，肾小球系膜基质分数减小，Ⅳ型胶原表达减低，说明肾小球的硬化程度得到改善。

　　大量临床试验已经证实，给伴有肾脏疾病的2型糖尿病患者使用AT1受体阻滞剂可以获得比安慰剂和其他抗高血压药物更好的肾脏保护作用。本研究在使用坎地沙坦干预12 w后，三组大鼠的血压无明显统计学差异，干预组大鼠的24 h UAE减少，肌酐清除率降低，说明肾小球的高滤过状态得到改善;同时肾小球硬化的程度减轻，充分证实了坎地沙坦独立于降压以为的肾脏保护作用。也就说明了这类药物的肾脏保护作用不只归因于对血压的控制〔4～6〕。

　　综上所述，糖尿病大鼠肾脏Ⅳ型胶原表达增加，坎地沙坦可降低Ⅳ型胶原表达，改善糖尿病大鼠肾脏结构和功能损伤，为DN的防治提供了重要的理论依据。

　　【参考文献】

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