ENPP1基因K121Q多态性与泰安地区人群2型糖尿病的相关

　　作者：张良1,吕雷立2,桑慧3,王宁1　　作者单位：1. 泰山医学院临床医学系，山东 泰安 271000 ; 2. 汕头大学医学院组织与胚胎学教研室，广州 汕头 515041 ;. 泰山医学院动脉粥样硬化研究所，山东 泰安

　　【摘要】目的探讨核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPP1)基因K121Q多态性与泰安地区人群2型糖尿病的相关性。方法 对居住在泰安的100例无血缘关系的2型糖尿病患者和150例健康对照者进行病例对照研究，运用聚合酶链反应限制性内切酶片段长度多态性 (PCRRFLP)方法分析ENPP1基因K121Q多态性，观察Q、K等位基因和KK、KQ、QQ基因型在正常对照组和2型糖尿病组中的分布情况。结果 糖尿病患者中KK基因型89例(89.00%),KQ基因型11例(11.00%),QQ基因型0例(0.00%),K、Q等位基因频率分别为94.50%和5.50%;正常对照组中KK基因型131例(87.33%),KQ基因型19例(12.67%),QQ基因型0例(0.00%),K、Q等位基因频率分别为93.67%和6.33%。在2型糖尿病患者和健康对照者之间，未发现基因型频率和等位基因频率的显著差别(P>0.05)。结论 ENPP1基因K121Q多态性和泰安地区人群2型糖尿病没有显著相关性。

　　【关键词】 ENPP1基因;基因多态性,2型糖尿病,聚合酶链反应限制性内切酶片段长度多态性

　　Abstract:Objective:To assess the association of Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1(ENPP1)gene K121Q polymorphism with type 2 diabetes (T2D) in Taian population. Methods: 100 unrelated T2D patients and 150 control subjects living in Taian were selected . ENPP1 gene K121Q polymorphism was determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphisms (PCRRFLP) and distributions of Q, K alleles and KK, KQ, QQ genotypes were observed in normal controls and type 2 diabetes patients. Results: The genotype frequencies in the experimental group and control group were 89.00%, 87.33%

　　for KK, 11.00%, 12.67% for KQ and 0.00%, 0.00% for QQ; The allele frequencies were 94.50%, 93.67% for K and 5.50%, 6.33% for Q. No significant difference was observed in either genotype distribution or allele frequency between type 2 diabetes and control groups(P>0.05). Conclusion: K121Q polymorphism of the ENPP1 gene has very little, if any, association with type 2 diabetes in Taian population.

　　Key words:ENPP1 gene; genetic polymorphism; type 2 diabetes; polymerase chain reaction; restriction fragment length polymorphism

　　2型糖尿病在我国有患者2000万以上，严重危害人类的健康。其发病机制主要为胰岛素抵抗，有证据表明胰岛素抵抗由多种内在因素决定，且能被个体遗传给后代。胰岛素抵抗可见于胰岛素受体基因的突变，但事实上，2型糖尿病患者鲜有发生胰岛素受体基因突变的案例。近年来，科研工作者在2型糖尿病患者的肌肉、皮肤和脂肪组织中发现了一种高度表达名为核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶1 (ENPP1)的糖蛋白，ENPP1通过结合胰岛素受体α亚基引起胰岛素受体酪氨酸蛋白磷酸化水平的降低，进而阻碍胰岛素信号的传导[1]。ENPP1基因的编码区具有多个单核苷酸多态性位点，其121Q等位基因可以提高ENPP1对胰岛素受体的阻碍作用[2]。近年来，学者们研究了ENPP1基因K121Q多态性和2型糖尿病在不同人群中的关系，并且得到了许多具有争议的结论，因此我们采用聚合酶链反应限制性内切酶片段长度多态性(PCRRFLP)方法来研究ENPP1基因K121Q多态性和泰安地区人群2型糖尿病的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　研究对象均为山东泰安地区汉族人群。2型糖尿病患者100例，男52例，女48例，年龄(56.4±12.1)岁，所有病例之间均无血缘关系。诊断按照1997ADA推荐标准,即空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L,排除空腹血糖受损及口服糖耐量异常。所有样本均由泰安市中心医院内分泌科提供。健康对照者150例，男78例，女72例，年龄(55.2 ±15. 1)岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因提取与PCRRFLP 基因组DNA提取采用TIANGEN公司全血基因组DNA提取试剂盒进行。根据Primer Premier 5.0设计软件设计引物序列如下：上游：5'CTGTGTTCACTTTGGACATGTTG3'，下游：5'GACGTTGGAAGATACCAGGTTG3'，扩增片段为238 bp。扩增50 μl体系。反应程序：95℃变性　30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。 PCR反应结束后，2%的琼脂糖凝胶上电泳30 min，观察结果。琼脂糖凝胶DNA回收采用SOLARBIO公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。回收后用限制性内切酶AvaⅡ酶切DNA，10 μl酶切反应体系，30℃温育1 h后，在2%琼脂糖凝胶上电泳20 min，在凝胶成像分析系统内观察结果并采图。

　　1.2.2 统计学处理 计算基因型频率和等位基因频率，以HardyWeinberg平衡检验研究对象的群体代表性，采用χ2检验比较组间基因型频率和等位基因频率的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 AvaⅡ酶切PCR产物结果

　　将酶切产物经2%的琼脂糖凝胶电泳20 min，在BIOBAD凝胶成像系统下观察，未变异的纯合子电泳仅见238 bp一条带(基因型为KK);变异的纯合子可显示148 bp和90 bp两条带(基因型为QQ);变异的杂合子电泳带型见238 bp、148 bp及90 bp三条带(基因型为KQ)。如图1。

　　图1 酶切产物琼脂糖凝胶电泳图

　　注:M为Marker;1,2分别为KQ，KK基因型。

　　基于我们所筛选的研究对象，在实验结果中没有出现QQ基因型。

　　2.2 HardyWeinberg遗传平衡检验

　　分别对病例组和对照组的基因型频率进行遗传平衡检验,χ2检验结果显示实际数与理论数差异无统计学意义(病例组：χ2=0.313, P=0.855;对照组：χ2=0.648,P=0.723) , 病例组和对照组基因型频率符合HardyWeinberg 遗传平衡定律，具有群体代表性。

　　2.3 相关性检验

　　2型糖尿病组与对照组ENPP1基因K121Q基因型和等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)见表1，2 。表1 两组基因型的构成表2 两组等位基因的构成

　　3 讨 论

　　我们使用居住在泰安的100例无血缘关系的2型糖尿病患者和150例健康对照者进行病例对照研究，来探讨ENPP1基因K121Q多态性的分布情况，结果没有在2型糖尿病患者和健康对照者之间发现基因型频率和等位基因频率的显著差别。

　　Mastsuoka N等[3]研究表明对于高加索人群和非洲裔美国人群等位基因Q与2型糖尿病的发生无关，同时他的研究证明了等位基因K而非等位基因Q 与肥胖的发生有关。Lyon HN等 [4]通过对2873例欧洲裔美国人和波兰人，188例非洲裔美国人，和以家庭为单位的866例非洲裔美国人所进行的研究，未发现ENPP1基因K121Q多态性与2型糖尿病和体重指数(BMI)有任何相关性。 通过对生活在英国的8089例高加索人群[5]进行的研究，未发现ENPP1基因K121Q的多态性与2型糖尿病的遗传易感性有关联。Grarup N等[6]研究发现ENPP1基因K121Q多态性与丹麦白种人患2型糖尿病之间无显著相关性，而121QQ基因型与过度肥胖(BMI>25)之间具有显著相关性;Keshavarz P 等[7]报道日本人群中携带ENPP1基因变异体的人患2型糖尿病危险性并未增加。以上学者的研究结论和我们的结论相同。然而仍然有部分学者和我们持有相反的结论。Bacci S[8]通过对2834例2型糖尿病患者和4425例健康对照者进行的病例对照研究，报道ENPP1基因K121Q多态性和胰岛素抵抗以及2型糖尿病患者动脉粥样硬化的发生有关联。 Meyre D[9]进行了一项针对法国人和澳大利亚人的研究，使用了1255例2型糖尿病患者和1314例健康对照者，得出了K121Q的等位基因Q和2型糖尿病的发生有关联的结论。Nicola Abate[10]对三种不同人群(包括679例生活在印度的土著居民，1083例生活在达拉斯和卡萨斯的南亚移民，以及858例生活在达拉斯和卡萨斯的土著高加索居民)进行了深入研究，证明了在南亚人群和高加索人群中ENPP1基因K121Q的多态性与2型糖尿病的遗传易感性有关联。

　　基于本研究所筛选的研究对象以及获得的研究结果，我们初步得出结论ENPP1基因K121Q多态性和山东泰安地区人群2型糖尿病没有显著相关性。本实验由于所采取的样本量较少，为了进一步排除该基因与2型糖尿病的相关性，还应进一步扩大样本量，并结合病人各项生理指标进行分析。

　　【参考文献】

　　[1] Maddux BA, Goldne ID. Membrane glycoprotein PC1 inhibition of insulin receptor function occurs via direct interaction with the receptor subunit[J]. Diabetes, 2000, 49 (1) : 1319.

　　[2] Costanzo BV, Trischitta V, Di Paola R, et al. The Q allele variant (GLN121) of membrane glycoprotein PC1interacts with the insulin receptor and inhibits insulin signaling more effectively than the common K allele variant (LYS121) [J]. Diabetes, 2001, 50 (4) : 831836.

　　[3] Matsuoka N, Patki A, Tiwari HK, et al. Association of K121Q polymorphism in ENPP1(PC1) with BMI in Caucasian and AfricanAmerican adults[J]. Int J Obes(Lond), 2006, 30 (2) : 233237.

　　[4] Lyon HN, Florez JC, Bersaglieri T, et al. Common variant in the ENPP1 gene are not reproducibly Association with diabetes or obesity[J]. Diabetes, 2006, 55 (11) : 31803184.

　　[5] Weedon MN, Shields B, Hitman G, et al. No evidence of association of ENPP1 variants with type 2 diabetes or obesity in a study of 8,089 U.K. Caucasians [J]. Diabetes, 2006, 5 (11) : 31753179.

　　[6] Grarup N, Urhammer SA, Ek J, et al. Studies of the relationship between the ENPP1 K121Q polymorphism and type 2 diabetes, insulin resistance and obesity in 7333 Danish White subjects[J]. Diabetologia, 2006, 49 (9) : 20972104.

　　[7] Keshavarz P, Inoue H, Sakamoto Y, et al. No evidence for association of the ENPP1(PC1)K121Q variant with risk of type 2 diabetes in a Japanese population[J]. J Hum Genet, 2006, 51 (6): 559566.

　　[8] Bacci S, Ludovico O, Prudente S, et al. The K121Q polymorphism of the ENPP1/PC1 gene is associated with insulin resistance/atherogenic phenotypes, including earlier onset of type 2 diabetes and myocardial infarction [J]. Diabetes, 2005, 54 (10) : 30213025.

　　[9] Meyre D, BouatiaNaji N, Tounian A, et al. Variants of ENPP1 are associated with childhood and adult obesity and increase the risk of glucose intolerance and type 2 diabetes[J]. Nat Genet, 2005, 37 (8) : 863867.

　　[10] Abate N, Chandalia M, Satija P, et al. ENPP1/PC1 K121Q polymorphism and genetic susceptibility to type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2005, 54 (4) : 12071213.