益肾胶囊对系膜增殖性肾小球肾炎大鼠肾脏NFκB及PDGFβ表达的影响

　　作者：朱本章，蒲丹 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 临床工作中，自身免疫病的治疗极具挑战性，传统上采用的糖皮质激素和免疫抑制剂等化学药品治疗虽然有效，但长期使用都不可避免的带来很多毒副作用。近10余年来，基于该病发病机制中不同环节的特异性生物学治疗成为热点，它们的应用使治疗过程能够终止自身免疫反应的破坏作用而又不伤害正常的免疫防御系统成为可能。

　　【关键词】 自身免疫病;传统治疗;生物学治疗

　　Advancement of biological therapy for autoimmune diseases

　　Zhu Benzhang, Pu Dan

　　(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Treating autoimmune diseases (AID) is a challenge for physicians. Traditionally, we use cortisone or other immune inhibitors to treat AID although we know that these kinds of drugs can cause some severe toxic action on patients if used longer. For over ten years, the biological therapy for AID, which specially targets to the pathogenesis of AID, has long been engaged in the study. These new drugs can protect the normal immune system while stopping undesirable immune reaction to the target organ.

　　KEY WORDS: autoimmune disease (AID); traditional therapy; biological therapy

　　自身免疫病(autoimmune disease, AID)是一组临床表现广泛的疾病，国际上认为是“5D”病，即痛苦(discomfort)、残废(disability)、药物中毒(drug toxicity)、经济损失(dollar loss)和死亡(death)。自身免疫病的治疗目标主要是修补特定的免疫缺陷或改变整个免疫反应，目的是在不破坏正常的免疫防御的前提下能够终止自身免疫反应的破坏作用。但事实上对于每一位临床医师来说，该类疾病的治疗极具挑战性，通常采用的糖皮质激素和免疫抑制剂等化学药品治疗虽然有效，但长期使用都不可避免的带来很多毒副作用，使病情得到缓解的同时增加了患者发生肿瘤和感染扩散的危险。近10余年来，基于该类疾病发病机制中不同环节的特异性的生物学治疗已成为研究的热点，并有着可能发展为临床治疗的趋势。因此，本文就此领域的进展作一综述。

　　1 针对T细胞的生物学治疗

　　表型为CD4+CD25+FOXP3+的T细胞(regulatory T cell, Treg)是一种具有免疫调节作用的细胞群，通过直接细胞接触或分泌调节性细胞因子，主动抑制T细胞的活化与增殖，在维持机体免疫耐受、免疫应答稳态和防止发生自身免疫性疾病中起重要作用。来自胸腺的天然型Treg 细胞除了通过直接接触及细胞因子依赖机制抑制反应性T细胞的活化与增殖外，尚能诱导其他CD4+的T细胞亚群向抑制性T细胞转变。故诱导Treg细胞亚群的增殖成为生物治疗的新途径。但是，这类细胞亚群在外周循环中数量极少。近来有研究表明，在体外与负荷抗原信息的耐受性树突状细胞共培养，或利用白介素2和转化生长因子β可使大量未接触抗原的T细胞分化成CD4+CD25+FOXP3+的Treg细胞。这些细胞具有与天然型Treg细胞相同的表型和功能，同样可以诱导CD4+CD25-细胞产生抑制能力，从而能保持抗原特异性CD4+调节细胞的不断更新[1]。在小鼠的实验性自身免疫性甲状腺炎研究中，发现Treg细胞在体内、外具有明显抑制小鼠效应性T细胞的功能，因而具有抑制小鼠发生自身免疫性甲状腺炎的作用[2]。

　　2 针对B细胞的生物学治疗

　　B淋巴细胞具有高效的抗原提呈作用，除了非特异的胞饮外，还借其表面的B细胞受体结合并浓集抗原，通过胞饮和加工后，以抗原主要组织相容性复合体分子复合物的形式提呈给T细胞。由于B细胞受体对特异性抗原的高亲和力，即使在抗原浓度非常低的情况下，B细胞也能高效地产生自身抗体、发挥抗原提呈和调节其他免疫细胞的作用。因此，耗竭B细胞已成为自身免疫病可能的治疗策略。

　　2.1 CD20单抗 作为B细胞特异性抗原，绝大部分CD20分布于B淋巴细胞表面，影响B细胞激活、识别、及细胞周期从G1期到S期的进展。因此，CD20对B细胞的增殖与分化有十分重要的作用。一种鼠人型的抗CD20的单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab, RTX, 美罗华)可以选择性的大量清除B细胞。1997年获美国FDA批准用于治疗人类恶性、顽固性滤泡低分化非霍奇金淋巴瘤，疗效尚令人满意[3]。目前，许多学者又将该药试验性地推广用于治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等其他自身免疫病。利妥昔单抗治疗RA：2004年Edwords等[4]报道了RTX治疗RA 的随机、双盲对照研究的结果。在这项共有161例患者参加，所有患者均为活动期，且对先前的改善症状的抗风湿药治疗无效。患者被随机分为单用甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)对照组、单用RTX组、RTX加环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)组和RTX加MTX组。所有RTX的用量均为1000mg/次，每2周静滴1次，共2次。治疗24周和48周后，同时用美国风湿病学会标准与欧洲抗风湿病联盟标准评估治疗效果。结果显示在所有使用RTX治疗组中，RA的缓解率显著高于对照组(65%-76% vs. 38%，以美国风湿病学会标准标准判断;83%-85% vs. 38%，以欧洲抗风湿病联盟标准判断)，并且在RTX联合MTX组，所有RA的缓解一直保持到48周。利妥昔单抗治疗SLE： 传统观点认为，SLE的发生是由于致病性T细胞促使B淋巴细胞的高度活化而产生多种自身抗体引起发病。事实上外周特异的细胞因子能够增强B细胞的增殖能力，而且T细胞通过协同刺激分子可产生某些抗凋亡信号均可导致更多的自身反应性B细胞产生更多的自身抗体以致组织损伤。因此，B细胞的功能紊乱亦是SLE的重要发病原因。目前，利妥昔单抗已被试验性用于治疗SLE。Ⅰ、Ⅱ期临床试验提示，RTX可使约2/3难治性重症SLE患者得到临床缓解，并且耐受性好。Leandor等[56]先后对30例严重活动性SLE在口服大剂量激素和2次750mg CTX静脉冲击的同时，静脉应用RTX 500-1000mg/次，共2次，结果发现除1例失访外，其他24例患者在随访6个月时全身症状、皮肤损害和关节症状均得到改善，抗dsDNA和补体C3水平也明显改善，有2例患者分别在用药后2-4年无复发，且未再用免疫抑制剂。CD20 单抗的问世为自身免疫疾病开创了一个新的治疗靶位，并对B细胞在自身免疫疾病中的作用有了重新认识。自1997年至今，已有超过125000例患者接受了该药的治疗。首次输注时会引起发热、寒战和偶有的低血压，但绝大多数患者能较好耐受，或仅需门诊治疗。但是，在B淋巴细胞靶位治疗成为自身免疫疾病常规疗法以前，仍有很多需解答的问题。譬如，自身免疫疾病治愈的金标准尚未形成共识，使该药疗效的评判缺乏良好的参照，在已发表的论文中缺乏良好的随机对照，多中心临床试验由于缺乏仔细的长期临床观察，研究结果的真实价值和对不良反应的认识还非常有限。

　　2.2 B淋巴细胞刺激因子拮抗剂 B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS/BAFF)是肿瘤坏死因子超家族新成员，对B细胞的增殖、分化及成熟有强烈的共刺激作用，并促进B细胞分泌免疫球蛋白。鉴于BLyS具有明显的B细胞趋向性，以BLyS或其受体为靶点，人为改变BLyS免疫调控信号，阻断其与受体的结合，有望在治疗SLE方面有新的突破。目前，正在研发的抗BLyS单克隆抗体有LymphoStat2B。这种抗BLyS抗体与人BLyS具有高亲和力, 通过抑制BLyS和受体结合，降低B细胞的增殖和活化。在对小鼠和猕猴的研究发现，LymphoStat2B可以预防人BLyS诱导的脾B细胞增殖及降低IgA抗体的滴度。近期，来自SLE患者的Ⅰ期临床试验资料表明，LymphoStat2B对患者具有明显的疗效, 并具有安全性和易于耐受的优点，现已进入Ⅱ期临床试验阶段。除了抗BLyS单克隆抗体外，BLyS的可溶性受体也将在SLE的临床治疗中发挥重要作用。动物实验证实[7]，给予SLE模型小鼠BLyS可溶性受体融合蛋白(TACIIg和BAFFRIg)，通过与TACI(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor) 和BAFFR竞争性结合BLyS，从而阻断细胞内信号传导通路，可明显抑制B细胞的活性，减少外周血B细胞的数目，促使抗dsDNA抗体水平降低甚至消失，减轻蛋白尿，延缓疾病进程。目前，BAFFRIg正在进行临床前研究，TACIIg已进入I期临床实验，其疗效有待进一步分析。

　　3 抑制T细胞活化和TB细胞间相互作用的生物制剂

　　3.1 抗CD40配体(CD40L)单抗 CD40/CD40L是T细胞活化的共刺激信号之一。CD40分布于B细胞、抗原递呈细胞和内皮/上皮细胞表面，与活化T细胞表面的CD40L结合后引起B细胞增殖、分化。活动期SLE患者外周血单个核细胞CD40L的表达增强且持续时间长，达到足够介导B细胞活化的水平[4]。抗CD40L的治疗至少可以通过抑制体液免疫的三个不同阶段来抑制生发中心的形成和抗体反应：①抗CD40L可以阻断位于或者毗邻淋巴结和脾脏胸腺依赖区的抗原特异性T、B细胞初始的同源性相互作用，从而可以阻止生发中心的形成和初次浆细胞的产生。②抗CD40L可以阻止生发中心暗区中处于增殖状态的中央母细胞之间CD40和CD40L的作用。③抗CD40L干扰生发中心亮区中T细胞和中央细胞的相互作用。目前，已有二种商品化的抗CD40L单抗IDEC131和BG9588进入临床试验阶段[8]，其中一种因为可以造成慢性血小板减少性紫癜而已停止使用，另一种也因在I期临床试验中的疗效与对照无明显差异而未进行进一步的临床试验。

　　3.2 抗细胞毒T细胞抗原4抗体 细胞毒T细胞抗原4(cytoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA4)是一种在活化T细胞表面表达的抗原，在T细胞活化中起第二信号的作用，它与T细胞表面的B7分子结合后可以抑制T细胞的进一步活化。抗CTLA4抗体(CTLA4Ig)是CTLA4的细胞外功能基团和IgG1Fc段的融合蛋白，可以阻断T细胞活化和依赖T细胞的B细胞功能。Wofsy等[9]证实NZB/W鼠输注CTLA4Ig后可以阻断自身抗体的产生，延缓狼疮肾炎的进展，进而延长生命。

　　4 针对细胞因子的生物学治疗

　　细胞因子在免疫反应以及由抗原提呈细胞介导的记忆反应中均发挥了重要的作用。因此，抑制调节病理性自身免疫反应的细胞因子， 成为近年来自身免疫病生物治疗方面的研究热点。

　　4.1 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)单克隆抗体——利昔单抗 英夫利昔单抗(infliximab，remicad)是TNFα的鼠人嵌合型单克隆IgG抗体，其中75%为人源化，25%为鼠源化，通过中和TNFα的促炎作用而发挥药理作用。英夫利昔单抗用于RA的治疗：由多国参加的ATTRACT试验证实了英夫利昔单抗治疗RA的有效性[10]。试验在给患有严重RA的428例患者服用MTX后，随机服用安慰剂和英夫利昔单抗。目前的结果显示，只用MTX的患者病情在继续发展，而4个英夫利昔单抗治疗组中的2组患者病情完全稳定，即使是对一些使用该药物症状无改善的患者，它也能延缓病情发展。60%-70%的患者用药后症状改善，而关节损伤进程得到延缓的比例更高，甚至一些患者关节结构的损伤完全停止。英夫利昔单抗用于SLE的治疗：活动的SLE患者的血浆中TNFα的含量不仅上升， 而且和疾病的活动度一致。同时，狼疮肾炎患者肾组织的TNFα水平亦有所升高，而且和局部的疾病活动度成正相关。因此，采用抗TNFα治疗SLE具有了一定可行性。SU等[11]发现用英夫利昔单抗治疗SLE后，疾病的活动度迅速减弱，不仅能缓解难治性SLE患者的关节症状，还能减轻SLE肾炎患者的蛋白尿，但这一现象和自身抗体的变化并不一致。另外，美国Abbott公司已利用噬菌体展示技术开发了一种人源化的抗TNFα抗体，现称为Adalimumab(曾命名为D2E7，商品名为HUMIRA), 与TNFα的亲和力很高。已发表的试验结果表明Adalimumab对RA的疗效确切。目前, 在欧洲和北美地区正在开展针对Adalimumab的4个临床试验，有超过2000名的RA患者参加，更全面地评价Adalimumab对RA的治疗效果。虽然抗TNFα的治疗能够削弱炎症反应，但一些免疫相关的副作用亦随之而产生。临床试验证实， 接受这种治疗的RA及Crohn病患者体内会产生抗核抗体、抗双链DNA抗体以及抗磷脂抗体，个别患者甚至发生了狼疮样综合征。这些抗体多属IgM型，在多数情况下终止治疗，以上症状及产生的抗体均可消失。

　　4.2 肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)与Fc的融合蛋白 TNFR与Fc的融合蛋白是将TNF受体膜外区与抗体的Fc段连接形成的融合蛋白，既可与TNFα结合，又增加了稳定性，而且通过Fc段可形成二聚体，比天然出现的单体受体对TNFα有更大的亲和力[12]。经过近10年的研究, 商品化的TNFRFc融合蛋白，称为益赛普(Etanercept)，已被FDA批准上市，用于治疗RA、强直性脊椎炎和抑制银屑病患者的骨和关节损伤。 益赛普对RA和强直性脊椎炎的治疗效果已为多个研究小组的临床试验充分证实[13]。应用益赛普治疗最常见的副作用为轻度的注射部位反应和轻度的上呼吸道症状，罕见病例可感染结核或者发生淋巴瘤，具体机制尚有待进一步的研究。

　　4.3 抗IL10单抗 免疫复合物可以刺激外周血单个核细胞合成IL10。IL10可以加速T细胞凋亡，引起受T细胞调节的B细胞出现合成抗体功能的缺陷。动物实验表明，给NZB/W小鼠使用抗IL10单抗后，可以推迟SLE发病，同时可以抑制小鼠外周血单个核细胞产生抗dsDNA抗体。目前，重组的人IL10已被研制出来，正在进行着包括RA、SLE、炎症性肠病等在内的临床试验。

　　5 自身免疫病治疗性肽疫苗的研究

　　应用特异性抗原诱导免疫耐受治疗自身免疫病已有很长历史。该方法可高度选择性地抑制针对特定抗原的淋巴细胞克隆，使机体重新获得对自身抗原的免疫耐受，而对机体正常免疫功能基本没有影响，克服了传统化学类药物的毒副作用。与其他种类的肽疫苗研究一样，自身抗原表位的筛选和鉴定是自身免疫病耐受性肽疫苗研究的关键[18]。

　　5.1 SLE肽疫苗 诱导SLE发病的自身抗原来自于凋亡的外周血单一核细胞，种类繁多，对关键或主要自身抗原的确定一直是SLE研究的难点。因此，对SLE肽疫苗的研究也相对复杂。虽然，目前没有进入临床实验阶段的肽疫苗出现，但是一些实验结果令人鼓舞。基于dsDNA抗体的Th细胞表位耐受研究：一些实验室针对dsDNA抗体的可变区重链，筛选和鉴定出若干表位，并进行一系列的免疫耐受研究。美国辛辛那提大学的Singh等[14]对其中的3条表位采用联合静脉途径的方式进行免疫耐受实验，结果显示狼疮鼠的血清dsDNA抗体水平显著降低，血清肌酐水平和蛋白尿等临床症状明显改善，生存时间也有所延长。但是，该耐受效应仅仅对较幼龄的、尚未发生狼疮性肾炎的狼疮鼠有治疗作用，而对20周龄的狼疮鼠治疗效果则不明显。提示这些表位对狼疮鼠体内已经存在的记忆性T细胞无诱导耐受作用。基于核小体组蛋白Th细胞表位的免疫耐受研究：核小体是在细胞凋亡过程中，核酸内切酶切割核染色质形成的产物。众多动物实验提示核小体可能在SLE的发病中发挥重要作用。以NZW型狼疮鼠为研究对象，Datta等[15]进行了基于核小体表位的肽耐受研究，结果显示在核小体表位肽不但可阻断小龄狼疮鼠(3月龄)致病性抗体的产生，推迟狼疮肾炎的发生，而且对大龄(18月龄)且已经发生肾炎的狼疮鼠，也可阻止其疾病进展、延长生存时间。需要指出的是，目前对核小体致病性的认识主要基于狼疮鼠的研究，而狼疮鼠的发病机制与人类显著不同，核小体究竟在人类SLE的发病和病情进展中的作用如何、是否作为一种真正的始动抗原参与发病还不明确。因此，对基于核小体表位的肽疫苗的研究仍需要在其他SLE动物模型及SLE患者中进一步证实和深入。

　　5.2 RA肽疫苗 人软骨糖蛋白(HCgp39)是人类RA重要的自身抗原成分之一，AG4263是来源于HCgp39的一个13个氨基酸的短肽。Kavanaugh等[16]对31例RA患者用AG4263进行了6周的耐受治疗，结果显示AG4263具有较好的耐受效果，而且没有对免疫系统的普遍性抑制等副作用。Bayrak等[17]以佐剂性关节炎小鼠为研究模型，探讨了用II型胶原表位肽p707721通过鼻黏膜途径诱导免疫耐受防治RA的效果，结果显示在大剂量和长期应用的条件下，该表位肽可以较好抑制牛II型胶原诱导小鼠产生的关节炎症反应。利用耐受性肽疫苗治疗自身免疫病涉及多种复杂机制和因素,包括免疫频率、免疫途径、剂量、患者机体免疫状态等。这些均可显著影响免疫耐受的效果，严重的甚至可以反过来进一步诱发新的自身免疫，使病情恶化。由于AID肽疫苗的研究仍处于起始阶段，而且绝大多数AID的发病机制均差别很大，因此肽疫苗的应用目前仍缺乏公认、统一的操作规程或步骤，在以后研究中需要对疫苗的途径、剂量等多项因素进行进一步的优化。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30370678)

　　【参考文献】

　　[1]Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ T regulatory cell for immunologic selftolerance and negative control of immune responses [J]. Annu Rev Immunol, 2004, 22:231262.

　　[2]Horwitz DA, Zheng SG, Gray JD, et al. Regulatory T cell generated ex vivo as an approach for the therapy of autoimmune disease [J]. Semin Immunol, 2004, 16(2):135143.

　　[3]Ansell SM, Tschumper RC. Chemokine upregulation in response to ritucimab in Bcell nonHodgkin lymphoma [J]. Blood, 1999, (94):377383.

　　[4]Jonathan CW, Ewards JCW, Szczepanski L, et al. Efficacy of B cell targeted therapy with ritucimab in patients with rheumatoid arthritis [J]. New Engl J Med, 2004, 350(25):25722581.

　　[5]Leandor MJ, Edwards JC, Cambridge G, et al. An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus [J]. Arthritis Rheum, 2002,46(10):26732677.

　　[6]Leandro MJ, Cambridge G, Edwards JC, et al. B cell depletion in the treatment of patients with systemic lupus erythematosus: a longitudinal analysis of 24 patients [J]. Rheumatology, 2005,44(12):15421545.

　　[7]Zhang X, Park CS, Yoon SO, et al. BAFF supports human B cell differentiation in the lymphoid follicles through distinct recptors [J]. Int Immunol, 2005, 17(6):779788.

　　[8]Kenneth CK, John CDJ, Joan TM, et al. AntiCD40L: A randomized, doubleblind, placebocontrolled trial [J]. Arthritis Rheum, 2002, 46(12):32513258.

　　[9]Finck BK, Wofsy D,Wofsy D. Treatment of murine lupus with CTLA4Ig [J]. Science, 1994, 265(5176):12251227.

　　[10]Lipsky PE, van der Heijde Desiree MFM, Clair EWS, et al. Infliximab and methotrexate in the treatment of rheumatoid arthritis. antitumor necrosis factor trial in rheumatoid arthritis with Concomitant therapy study group [J]. New Engl J Med, 2000, 343(22):15941602.

　　[11]Su X, Zhou T, Yang P, et al. Reduction of arthritis and pneumonitis in motheaten mice by soluble tumor necrosis factor receptor [J]. Arthritis Rheum, 1998, 41(1):139149.

　　[12]Gaur U, Aggarwal BB. Regulation of proliferation, survival, apoptosis by members of the TNF superfamily [J]. Biochem Pharmacol, 2003, 66(8):14031408.

　　[13]Morland LW, Baumgartner SW, Schiff MH, et al. Treatment of rheumatoid arthritis with the recombinant human tumor necrosis factor receptor (p75)Fc fusion protein [J]. New Engl J Med, 1997 337(3):141147.

　　[14]Singh RR, Ebling FM, Sercarz EE, et al. Immune tolerance to autoantibodyderived peptides delays development of autoimmunity in murine lupus [J]. J Clin Invest, 1995,96(6):29902996.

　　[15]Kaliyaperumal A, Michaels MA, Datta SK. Antigenspecific therapy of murine lupus nephritis using nucleosomal peptides: tolerance spreading impairs pathogenic function of autoimmune T and B cells [J]. Immunol, 1999, 162:57755783.

　　[16]Kavanaugh A, Genovese M, Baughman J, et al. Allele and antigenspecific treatment of rheumatoid arthritis: a doubleblind, placebocontrolled phase I trial [J]. J Rheumatol, 2003, 30(3):449454.

　　[17]Bayrak S, Mitchison NA. Bystander suppression of murion collageninduced arthritis by long term nasal administration of a self type II collagen peptide [J]. Clin Exp Immunol, 1998, 113(1):9295.

　　[18]史进方，顾国浩，陈见奇，等. 蛋白芯片技术对8种自身抗体的检测及评价[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2005, 26(1):5760.